1. Interacción
ácidos nucleicos-proteína
Sergio Iván Angles Falconi

2. DNA/RNA-proteínas
En el siglo 19, los científicos observaron microscópicamente los asociación de
proteínas con cadenas de ADN en la célula. Desde entonces, los investigadores han
demostrado a través de una variedad de ensayos in vitro e in vivo ensayos que las
proteínas interaccionan con el ADN y ARN para influir la estructura y la función del
ácido nucleico correspondiente. Elucidar los papeles que estos complejos proteína:
ácido nucleico desempeñan en la regulación de la transcripción, la replicación del ADN
traducción, reparación y recombinación, y el procesamiento del ARN y la translocación
continúa revolucionando nuestra comprensión de la biología celular, normal el
desarrollo de células y los mecanismos de la enfermedad.

3. Assays for Protein:DNA Interactions
Un número de técnicas de laboratorio se han desarrollado
para estudiar estas complejas interacciones cada uno con una
historia única, variando en su utilidad, las fortalezas y
debilidades distintas.
DNA Electrophoretic Mobility Shift Assay
(EMSA)

4. DNA Electrophoretic Mobility Shift Assay
(EMSA)
•EMSA se utiliza para estudiar la unión de una proteína a una sonda de
oligonucletidos de ADN que se conoce.
• Se puede utilizar para evaluar la afinidad de la interacción.
•La detección de una interacción importante se basa en la movilidad más
lenta del complejo proteína: ADN sobre una molécula de ADN libre moléculas
sobre electroforesis en gel de agarosa o piliacrilamida no desnaturalizante.

5. DNA Electrophoretic Mobility Shift Assay
(EMSA)
• La adición de un anticuerpo contra la proteína target crea un
complejo aún mayor (anticuerpo: proteína: ADN) que migra más
lentamente. Este resultado se conoce como supershift y se utiliza para
confirmar la identidad de las proteínas.
•Antes de que EMSA fuera desarrollado, las interacciones proteína:
ADN Se han estudiado principalmente por ensayos en filtro de
nitrocelulosa utilizando marcado radiactivo de sondas.

6. DNA Electrophoretic Mobility Shift Assay
(EMSA)
Fortalezas:
• detectar proteínas de unión al ADN de baja abundancia de lisados.
• Test de afinidad de unión a través de análisis de ADN sonda mutacional
• EMSA no radioactivo es posible usando biotina o sondas de ADN
marcadas con fluorescencia
Limitaciones:
• analiza las interacciones proteína: ADN in vitro
• difícil de cuantificar
• necesidad de realizar supershift con anticuerpos para confirmar la
identidad de la proteína en un complejo.

7. Marcadores del DNA
• Radioisótopos Autoradiografía
• Fluorocromos fluorescencia
• Biotina quimioluminiscencia
32P fosfato. Barato, sensibilidad (≤10 -18 moles),
y no introduce estructuras artificiales.
DNA/RNA
32P

8. Competidores no específicos
• Acido nucleico no marcado usado como agente bloqueador
en la reacción de unión para minimizar la unión de proteínas
no especificas a el DNA marcado.
• Mas usados poly(dl.dC)
• DNA de esperma de salmón sonicado

9. Competidores específicos
• Importante control usado para verificar la especificidad de
una banda resultante de la unión de proteínas a la sonda
marcada.
• Secuencia idéntica a la sonda marcada ó
• Contiene secuencias de uniones conocidas a la proteína
blanco.
• 200 moles de exceso son suficientes para competir

12. Utilidad EMSA
 Caracterizar los mecanismos de regulación transcripcional de varios genes.
 Caracterizar eventos transcripcionales conocidos para determinar el efecto
de diversos estímulos u otras proteínas que se requieren para llevar a cabo
la interacción
 Identificar la unión proteínas implicadas en procesos de
replicación, recombinación y reparación.
o No puede identificar si son varias proteínas las que se unen al RNA/DNA
o No puede saberse con exactitud que proteína se une al DNA/RNA

13. Super Retardamiento
• El ensayo EMSA es lo suficientemente sensible como para añadir un
anticuerpo específico que causa un “super-retardamiento” al unirse a la
proteína que esta unida al DNA/RNA.
• La movilidad de el complejo; anticuerpo-proteína-RNA/DNA es mucho
menor a la de la proteína-RNA/DNA que sirve como control, y a la del
DNA/RNA libre.

15. Utilidad
 Identificar particularmente la proteína que se esta uniendo al
complejo DNA/RNA.
o Reconocer complejos de proteínas que se unen al DNA/RNA
o Conocer el peso molecular de las proteínas o de los complejos
proteína/DNA-RNA

16. Entrecruzamiento (Crosslinking)
• Técnica para detectar el peso molecular del
complejo RNA/DNA-proteína.
Cuando se forma el complejo y se irradia con luz
UV, ocasiona la formación de enlaces covalentes
entre pirimidinas y ciertos residuos de a.a que
están cercanos al DNA.

17. SDS page
• Por el SDS (sodium dodecyl sulfate)
page, desnaturaliza y da carga negativa a las
proteínas revelando el peso molecular del complejo
formado.

20. Pasos
1. Contacto proteína recombinante o pull de
proteínas con DNA/RNA
2. Laser UV
3. Poner complejo en contacto con SDS
4. Correr electroforesis

21. Preparación de la muestra

22. Electrophoresis

23. Utilidad
 Determinar el peso molecular de complejo formado
 Medir la afinidad de DNA-proteína por constantes de unión
 Cuantificar la cantidad de DNA que se une a proteínas
especificas
 Revelar complejos heteroméricos y cofactores envueltos en la
unión.