Se describen 3 importantes métodos para determinar la interacción entre el DNA/RNA y proteínas. mayor información Juan Ospina candidato a Magister en ciencias en biomedicina molecular juando12358@gmail.com

1. Interacción
ácidos nucleicos-proteína
Juan David Ospina

2. DNA/RNA-proteínas

3. Retardamiento de la movilidad
electroforética (EMSA)
Se centra en el estudio de la regulación genética y en la
determinación de la interacción DNA/RNA-proteína.
La técnica se basa en la observación de que los complejos
DNA/RNA-proteína migran mas lentamente que las moléculas de
DNA libre cuando se somete a electroforesis en gel de agarosa o
de poliacrilamida no desnaturalizante.
• Michael Fried and Donald M. Crothers. Equilibria and kinetics of lac repressor-operator interactions by polyacrylamide gel electrophoresis
Nucl. Acids Res. (1981) 9 (23): 6505-6525. doi: 10.1093/nar/9.23.6505
• Garner MM, Revzin A. A gel electrophoresis method for quantifying the binding of proteins to specific DNA regions: application to
components of the Escherichia coli lactose operon regulatory system. Nucleic Acids Res. 1981 Jul 10;9(13):3047-60.

4. Marcadores del DNA
• Radioisótopos Autoradriografía
• Fluorocromos fluorescencia
• Biotina quimioluminiscencia
32P fosfato. Barato, sensibilidad (≤10 -18 moles),
y no introduce estructuras artificiales.
32P
DNA/RNA

5. Competidores no específicos
• Acido nucleico no marcado usado como agente bloqueador
en la reacción de unión para minimizar la unión de proteínas
no especificas a el DNA marcado.
• Mas usados poly(dl.dC)
• DNA de esperma de salmón sonicado

6. Competidores específicos
• Importante control usado para verificar la especificidad de
una banda resultante de la unión de proteínas a la sonda
marcada.
• Secuencia idéntica a la sonda marcada ó
• Contiene secuencias de uniones conocidas a la proteína
blanco.
• 200 moles de exceso son suficientes para competir

9. Utilidad EMSA
 Caracterizar los mecanismos de regulación transcripcional de varios genes.
 Caracterizar eventos transcripcionales conocidos para determinar el efecto
de diversos estímulos u otras proteínas que se requieren para llevar a cabo
la interacción
 Identificar la unión proteínas implicadas en procesos de replicación,
recombinación y reparación.
o No puede identificar si son varias proteínas las que se unen al RNA/DNA
o No puede saberse con exactitud que proteína se une al DNA/RNA

10. Super Retardamiento
• El ensayo EMSA es lo suficientemente sensible como para añadir un
anticuerpo específico que causa un “super-retardamiento” al unirse a la
proteína que esta unida al DNA/RNA.
• La movilidad de el complejo; anticuerpo-proteína-RNA/DNA es mucho
menor a la de la proteína-RNA/DNA que sirve como control, y a la del
DNA/RNA libre.

12. Utilidad
 Identificar particularmente la proteína que se esta uniendo al
complejo DNA/RNA.
o Reconocer complejos de proteínas que se unen al DNA/RNA
o Conocer el peso molecular de las proteínas o de los complejos
proteína/DNA-RNA

13. Entrecruzamiento (Crosslinking)
• Técnica para detectar el peso molecular del
complejo RNA/DNA-proteína.
Cuando se forma el complejo y se irradia con luz
UV, ocasiona la formación de enlaces covalentes
entre pirimidinas y ciertos residuos de a.a que
están cercanos al DNA.

14. SDS page
• Por el SDS (sodium dodecyl sulfate) page,
desnaturaliza y da carga negativa a las proteínas
revelando el peso molecular del complejo formado.

16. Pasos
1. Contacto proteína recombinante o pull de
proteínas con DNA/RNA
2. Laser UV
3. Poner complejo en contacto con SDS
4. Correr electroforesis

17. Utilidad
 Determinar el peso molecular de complejo formado
 Medir la afinidad de DNA-proteína por constantes de unión
 Cuantificar la cantidad de DNA que se une a proteínas
especificas
 Revelar complejos heteroméricos y cofactores envueltos en la
unión.