Este documento describe los diferentes métodos de secuenciación de ADN, incluyendo los métodos de primera generación como Sanger y pirosecuenciación, los métodos de segunda generación como secuenciación por síntesis utilizada por Illumina, y los métodos de tercera generación como secuenciación en tiempo real de Pacific Biosciences y Oxford Nanopore. Explica los principios, procedimientos y aplicaciones de cada método para determinar el orden de las bases nucleotídicas en una molécula de ADN.
3. SECUENCIACIÓN DEL ADN
La secuenciación de ADN es el proceso de lectura de
bases de nucleótidos en una molécula de ADN.
Secuenciar una molécula de ADN consiste en
determinar en qué orden se disponen los nucleótidos
(A, T, C y G) que componen la molécula.
7. SECUENCIACIÓN DE SANGER
El método Sanger, didesoxi o
secuenciación por terminación de la
cadena, fue diseñado por Fred
Sanger en 1977.
8. Para la secuenciación por el método de Sanger se necesitan:
un ADN de cadena sencilla que actúa como molde
un cebador para iniciar la síntesis de ADN
los cuatro desoxirribonucleótidos trifosfato (dATP, dGTP, dCTP
y dTTP)
la enzima ADN-polimerasa
los cuatro didesoxirribonucleótidos trifosfato (ddATP, ddGTP,
ddCTP y ddTTP)
10. SECUENCIACIÓN DE SANGER MEJORADO
El método Sanger mejorado
también se lo conoce con el
nombre de secuenciación cíclica.
11. Para la secuenciación por el método de Sanger mejorado se
necesitan:
un ADN de cadena sencilla que actúa como molde
un cebador para iniciar la síntesis de ADN
los cuatro desoxirribonucleótidos trifosfato (dATP, dGTP, dCTP
y dTTP)
la enzima Taq-polimerasa
los cuatro didesoxirribonucleótidos trifosfato (ddATP, ddGTP,
ddCTP y ddTTP) marcados con un fluoróforo distinto
15. Para la secuenciación por el método de
PIROSECUENCIACIÓN se necesitan:
un ADN de cadena sencilla que actúa como molde
un cebador para iniciar la síntesis de ADN
tres desoxirribonucleótidos trifosfato (dGTP, dCTP y dTTP) más
desoxiadenosina alfa-tiotrifosfato (dATP•S)
cuatro enzimas: ADN polimerasa, ATP sulfurilasa, luciferasa y
apirasa
adenosina 5'-fosfosulfato (APS)
luciferina
17. 454 PIROSECUENCIACIÓN
Desarrollado por la compañía 454 Life
Sciences (ahora Roche Diagnostics),
amplifica el ADN dentro de gotas de
agua en una solución de aceite
“emulsión de PCR”
18. Para la secuenciación por el método de 454
PIROSECUENCIACIÓN se necesitan:
un ADN de cadena sencilla que actúa como molde
un cebador para iniciar la síntesis de ADN
tres desoxirribonucleótidos trifosfato (dGTP, dCTP y dTTP) más
desoxiadenosina alfa-tiotrifosfato (dATP•S)
ADN polimerasa
nanoesferas de secuenciación
cuatro enzimas: ADN polimerasa, ATP sulfurilasa, luciferasa y apirasa
adenosina 5'-fosfosulfato (APS)
luciferina
24. SECUENCIADORES SOLID
(SUPPORT OLIGONUCLEOTIDE LIGATION DETECTION)
Desarrollado por Applied Byosistem (ahora
Termofisher), utilizan técnicas enzimáticas de
ligación y de emulsion de PCR, similar al de 454 a
excepción del anclaje final de las nanosesferas a
una superficie de cristal donde se da la
secuenciación.
25. Para la secuenciación por el método de 454
PIROSECUENCIACIÓN se necesitan:
un ADN de cadena sencilla que actúa como molde
un cebador para iniciar la síntesis de ADN
tres desoxirribonucleótidos trifosfato (dGTP, dCTP y dTTP) más
desoxiadenosina alfa-tiotrifosfato (dATP•S)
ADN polimerasa
nanoesferas de secuenciación
cuatro enzimas: ADN polimerasa, ATP sulfurilasa, luciferasa y apirasa
adenosina 5'-fosfosulfato (APS)
luciferina
28. SECUENCIACIÓN POR SÍNTESIS
Desarrollado por la compañía Illumina, permite
abaratar costos y ofrecer lecturas mas largas, sin
embargo, se requiere de una gran inversion
inicial y de mantenimiento, para poder adquirir y
mantener uno de los equipos que ofrece.
.
31. SECUENCIACIÓN EN TIEMPO REAL (SMRT)
SINGLE MOLECULE REAL TIME
Se caracteriza por asociar una polimerasa a una
matriz y seguir en tiempo real el proceso de
síntesis de una sola molécula de ADN, no se
construye bibliotecas, y aumenta la tasa de
producción de la secuencia Los más conocidos
son: Pacific Biosciences y Oxford Nanopore.
32. PLATAFORMAS PACIFIC BIOSCIENCES (PACBIO)
Esta tecnología permite obtener lecturas de hasta 1500
pb con un resultado final aproximado de 60-75 Mb. El
principal problema en el registro es la velocidad a la que
cada polimerasa sintetiza ADN, debido a las fluctuaciones
propias de cada enzima, por lo que cada enzima tiene
que controlarse individualmente y las adiciones de
nucleótidos deben ser registradas a la velocidad
adecuada en tiempo real.
33.
34. PLATAFORMAS OXFORD NANOPORE
Secuenciador portable que utiliza un bioporo
microscópico similar a una canal iónico de una
membrana plasmática, por el que transitan las moléculas
de ADN, produciendo una interrupción del voltaje a
través de un micro canal y cuyo registro permite
identificar la secuencia de nucleótidos
35.
36.
37. BIBLIOGRAFÍA
Rojas, P. 2018. Métodos de secuenciación de ADN
https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/Documents/PDFs/sequencing_h
andbook_FLR.pdf