Prepared by Alejandro Hernández and Isabella Montoya

2. Alejandro Hernández Martínez.
Isabella Montoya Botero.
UPB, Facultad de Medicina.
III Semestre.

3. INTRODUCTION
THE HIV
Image source: zbrushcentral.com
• Retrovirus, with an RNA
genome, responsible for AIDS
due to it's effects on the
immune system.
• Infects, mainly, T CD4 Cells,
lowering cell mediated
response. It can infect other
immne cells too.
• There are two types, where
HIV-1 is the most infectuos of
both. Either uses a Reverse
Transcriptase mechanism.

4. INTRODUCTION
Image source: www.scistyle.com

5. INTRODUCTION
Image source: www.scistyle.com

6. INTRODUCTION
REVERSE TRANSCRIPTASE
• Enzyme that allows DNA synthesis from an RNA template. Used by
retroviruses to incorporate it's genome on a host cell.
• With two enzymatic domains, a Polymarase and a RNase H, it allows the
transferation of genetic information from the virus to the cell.

7. INTRODUCTION
THE POLYMERASE
Image source: nextdoorpublishers.com
• Enzyme that synthesizes
polymers of nucleic acids,
either DNA or RNA.
• Binds nucleotides in a 5' --> 3'
sense in order to elongate a
chain using a template.
• It's chain is complementary to
the template. In the HIV, a DNA
polymerase complements an
RNA template.

8. INTRODUCTION
THE RIBONUCLASE
Image source: doctorbond.in
• Enzyme that cuts or degrades
RNA secuences. There are
many families, we are
interested in HIV's RNase H.
• There are many types with
different purposes like RNA
splicing, defense against
viruses amongst others.
• In the HIV, it helps with reverse
transcription allowing the
cleavege of the DNA:RNA
hybrid.

9. INTRODUCTION
Image source: Thermo Fisher Scientific

10. Human
Immunodef.
Virus
RNA Genome
DNA molecule
Reverse
transcriptase
DNA
Polymerase
RNase H
cDNA
synthesis
RNA
degradation
Cell Infection
Integrase

11. Identify how both domains
(Polymerase and RNase H) of
HIV-'s Reverse Transcriptase
(RT) coordinate with each
other in order to fully
complete the viral double
stranded DNA synthesis from
a single stranded RNA
molecule.
GENERAL OBJECTIVE
Image source: AIDS.gov

12. MATERIALES Y
MÉTODOS
¿Qué se
hizo?
¿Para qué? ¿Cómo?
Simulaciones
de Dinámica
Molecular
Predecir la
interacción
sustrato-
enzima
Análisis
computacional
Expresión y
Purificación
de Proteínas
Producir la RT
para el
experimento
Cultivo de
E.Coli con gen
para la RT
Modificación
del DNA
Obtener una
molécula para
unir la RT
Variación de
bases y
fosfatos

13. MATERIALES Y
MÉTODOS
Hibridación
RNA/DNA
Buscar
interacción
entre dominios
Formación de
enlaces con
aminoácidos
Purificación
de complejos
Separar los
resultados de
la reacción
Protocolo de
laboratorio
para extracción
Medición de la
actividad de la
RNAsa
Conocer la
actividad
enzimática
Electroforesis
y
Fluorescencia
Medición de la
afinidad por
nucleótidos
Establecer la
estructura de
la polimerasa
Electroforesis
y
Fluorescencia

14. MATERIALES Y
MÉTODOS
• Simulaciones de Dinámica Molecular (DM):
Método computacional
que busca simular la
interacción entre
partículas.
Se basa en la
predicción de
la actividad
molecular.
Utiliza cálculos de
biofísica y
bioquímica para
realizar
estimaciones.
Se usa como método
de referencia para
saber la viabilidad del
experimento y los
posibles resultados.

15. MATERIALES Y
MÉTODOS
• Expresión y purificación de proteínas:
Célula de E. Coli
Gen de la RT
Síntesis
de enzima
Transcriptasa Reversa
Experimentos
con la enzima

16. MATERIALES Y
MÉTODOS
• Modificación del DNA:
Cistamina
Oligonucleótido de DNA
DNA modificado
con tiol
Ácido dicloroacético
al 3% (desproteger
oligonucleótidos)
Lavado
con diclorometano

17. MATERIALES Y
MÉTODOS
• Modificación del DNA:
Incubación en
sln trimetilamina/agua
La muestra se suspendió en
1 ml de amoníaco/40% de
metilamina
DNA de las fracciones
seleccionadas se recuperó
por precipitación con
etanol y se purificó

18. MATERIALES Y
MÉTODOS
• Hibridación:
• Es la formación de una
molécula de doble cadena
a partir de dos cadenas
sencillas.
• Se colocan secuencias de
DNA y de RNA en un medio
que propicie la formación
del hibrido.
• La presencia en el medio
de la RT de HIV-1 permite
la formación de híbridos
en un complejo.
Oligonucleótidos
de RNA
marcados con
fluorescencia.
Oligonucleótidos
de DNA.
Híbrido de
RNA/DNA con
secuencias
complementarias.

19. MATERIALES Y
MÉTODOS
• Purificación de complejos:
Una vez formado el híbrido,
debe extraerse el complejo
enzima sustrato.
Los diferentes complejos
pasan por métodos que los
separan de otras moléculas
como proteínas libres.
El complejo consta de la
Transcriptasa Reversa unida
al Hibrido de RNA/DNA.
El complejo es usado para
realizar in vitro las
reacciones que se llevarían a
cabo para la producción
del cDNA.

20. MATERIALES Y
MÉTODOS
• Medición de la actividad de la RNAsa:
Muestras con
complejos de
60 Nm.
Preincubación
a 37◦C (30
min).
Sln patrón
(Tris y NaCl).

21. MATERIALES Y
MÉTODOS
• Medición de la actividad de la RNAsa:
Reacción de
escisión:
0,5, 5 ó 20 min
en presencia
de 8 mM de
MgCl.
Se detuvo
mediante la
adición de 40
mM de EDTA.

22. MATERIALES Y
MÉTODOS
• Electroforesis: Se utilizan las
moléculas de
diferentes RT
modificadas.
Image source: Slideshare.net
Permite evaluar
la formación de
complejos
funcionales.

23. MATERIALES Y
MÉTODOS
• Fluorescencia:
Se conserva el principio
básico de la electroforesis,
donde las moléculas migran
según su peso y carga.
Se usan geles TBE-Urea con
visualización fluorescente,
que permiten separar DNA
o RNA en bandas.
Dependiendo del producto
de la reacción, el
compuesto fluorescente
dará una mayor o menor
iluminación.
En el artículo, evalúa la
actividad de corte de
la RNAsa con respecto al
complejo formado.

24. RESULTADOS
• Simulaciones de Dinámica Molecular (DM):
Hallazgo más importante: no
se requiere la separación del
sustrato al sitio activo de
polimerasa para que se pueda
dar la interacción catalítica del
ácido nucleico con el dominio
RNasa H.
Interacción
catalítica
simultánea.

25. RESULTADOS
• Unión de complejos:
El sustrato no debe poder
acceder al sitio activo de RNasa
para poder llevar a cabo una
correcta transcripción inversa. La
degradación del RNA antes de
terminar la síntesis de cDNA
puede afectar el proceso.

26. RESULTADOS

27. RESULTADOS
• Actividad de la RNasa H dentro de los complejos enlazados:
Los resultados mostraron la eficacia de la actividad catalítica de la
RNasa, la cual actúa sobre los cuatro complejos, que son variantes
purificadas del VIH-1.

28. RESULTADOS
• Actividad de la RNasa H dentro de los complejos enlazados:

29. RESULTADOS
• Organización del sitio activo de la
polimerasa:
1. Para que se dé una unión efectiva y
específica del nucleótido, los elementos del
sitio activo de la polimerasa deben alinearse
correctamente.
2. Los iones Mg2+ y Ca2+ en el sitio activo
de la enzima coordinan los grupos fosfato
del ácido nucleico.

30. RESULTADOS
• Organización del sitio activo de la
polimerasa:
3. El apilamiento de las bases de los
nucleótidos entrantes requiere la
orientación correcta del cebador de
ADN y la organización adecuada del
residuo Arg72 en el sitio activo de la
polimerasa.
4. Para que se lleve a cabo el
emparejamiento de los nucleótidos,
debe haber una adecuada orientación
de la molécula de ARN.
- La unión del nucleótido
sólo ocurre si los
requisitos anteriores se
han cumplido.
- Indica que no se perturbó
la arquitectura del sitio
activo de la polimerasa con
la unión del sustrato.

31. DISCUSSION
AUTHOR WHAT THEY SAID YES OR NOT
Lapkouski, M. Et al. "For HIV-1 RT, coordination of the two
enzymatic activities relies on
conformational changes in the protein-
substrate complex."
Li,A. Et al. "Nucleotide incorporation and RNase H
cuts occurred simultaneously."
Also, they found that "the rate of
polymerization was limited by
pyrophosphate release and RNA hydrolysis
was limited by the requirement for an
intact stretch of RNA downstream of the
cleavage site."

32. DISCUSSION
AUTHOR WHAT THEY SAID YES OR NOT
Driscoll,M.D. Et al. "RNase H cuts have been shown to
occur when polymerization of the DNA
pauses."
Sevilya,Z. Et al. "The activity of HIV RNase H can be
influenced by multiple factors. Among
these are mutations in regions that are
distant from the active sites and the
substrate binding cleft or the addition
of nucleocapsid protein."

33. CONCLUSIONS
Simultaneous
action of RT's
active sites is a
process that
makes DNA
synthesis less
succesful due to
RNA
degradation.
Coordination
between both
domains of the
enzyme has
been proven so
important
it may work as
a therapeutic
target.
Understandig
the molecular
processes
behind HIV
helps on the
comprehension
of infection and
phatogenesis.
Reverse
transcriptase is
an example of
how
one enzyme
can fulfill
multiple
functions both
simultaneous
and
independently.

34. Alejandro's Cmap

35. Cmap de Isabella

36. BIBLIOGRAFÍA
• Figiel M, Krepl M et al (2017). Coordination between the polymerase and
RNase H activity of HIV-1 reverse transcriptase. Nucleic Acids Res.
• Douek DC, Roederer M, Koup RA (2009). "Emerging Concepts in the
Immunopathogenesis of AIDS". Annu. Rev. Med. 60: 471–84
• Ferris, AL; Hizi, A; Showalter, SD; Pichuantes, S; Babe, L; Craik, CS; Hughes,
SH (April 1990). "Immunologic and proteolytic analysis of HIV-1 reverse
transcriptase structure." . Virology. 175
• A. R. Leach (2001) Molecular Modelling: Principles and Applications.