Reacciones multisustrato

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Reacciones multisustrato

  1. 1. Tema 17 Reacciones multisustrato Reacciones enzimáticas con dos sustratos 1. Introducción 2. Nomenclatura 3. Reacción enzimáticas con 2 sustratos y 2 productos. 4. Cálculo de la ecuación de velocidad de reacción: Ecuaciones con dos substratos 4.1. Mecanismo Secuencial Bi Bi al azar. 4.2. Mecanismo Secuencial Bi Bi ordenado. 4.3.Mecanismo Bi BiPing-Pong
  2. 2. Hasta ahora hemos estudiado casos sencillos de transformación enzimática de un sustrato en un único producto. Sin embargo, en los sistemas biológicos, son casos excepcionales, restringidos a reacciones de isomerización. Las reacciones enzimáticas que implican a más de un sustrato, transformándolos en varios productos son las más frecuentes. 1.Introducción S + E <==> ES <==> EP <==> E + P - Y, a modo de ejemplo, podríamos citar las siguientes enzimas: - Por ejemplo: A + B  P + Q
  3. 3. Adenilato ciclasa Citrato sintasa Alcohol-DH Malato-DH Ribitol-DH Lactato-DH Coenzima-A transferasa Glutamato-alanina transaminasa Glucosa oxidasa etc. .... Estudio cinético: A) Velocidad inicial B) Depender la velocidad de la reacción de uno solo de los reactantes (Resto saturación). Reacción orden cero con respecto todos los substratos menos uno    SK S Vv   ` `max
  4. 4. a) En cuanto al número de sustratos y productos: Reacción Nombre A -----> P Uni-Uni A + B -----> P Bi-Uni A + B + C -----> P + Q Ter-Bi A + B -----> P + Q Bi-Bi b) En cuanto al orden en que entran los sustratos y salen los productos: * Reacciones secuenciales: - al azar - ordenadas * Reacciones de desplazamiento: - Ping-Pong 2. Nomenclatura
  5. 5. De acuerdo con la simbología de Cleland, el progreso de la reacción se simboliza por una línea horizontal. El trabajar con reacciones multisustrato, puede llegar a ser bastante complicado a la hora de representar los esquemas de las reacciones A lo largo de la Historia se han propuesto varios sistemas, pero el que más éxito ha tenido ha sido el propuesto por Cleland. La entrada de sustratos y la salida de productos se representan por flechas verticales que indican la dirección de entrada o salida de la reacción. - Para afianzar estos conceptos, veamos algunos ejemplos concretos de reacciones en las que intervienen 2 sustratos y se forman 2 productos:
  6. 6. E EEA E A P EB B Q E EEA EAB A B EQ P Q EPQ Desplazamiento: Uni-Uni-Uni-Uni Ping-Pong Secuencial: Bi-Bi ordenada
  7. 7. ¿Se atreve a nombrar los siguientes mecanismos? E E A B P QCa) E E A B C QPb) R E E A B CQPc) R
  8. 8. Reacciones bisustrato, del tipo Bi-Bi: A + B --- P + Q -Mecanismos secuenciales - al azar - ordenadas - Mecanismo ping-pong o de doble desplazamiento 3. Reacciones enzimáticas de dos sustratos y dos productos
  9. 9. A) Mecanismos secuenciales, Los dos sustratos se unen al centro activo antes de que se libere cualquiera de los productos. Es decir el complejo ternario EAB o EBA debe formarse como requisito indispensable antes de que se produzca la formación de productos. La formación del complejo ternario es independiente del orden de unión de los sustratos. Este tipo de reacciónes se denominan  reacciones secuenciales al azar, La formación del complejo ternario debe producirse en un orden determinado para que el complejo sea productivo desde el punto de vista catalítico. Este tipo de reacción se denomina  reacciones secuenciales ordenadas).
  10. 10. Analicemos, desde el punto de vista esquemático, estos dos tipos de reacciones secuenciales. Hagámoslo primero de acuerdo con un esquema clásico: E + A <=> EA E + B <=> EB EAB <=> EPQ EQ <=> E + Q EP <=> E + P B A P Q Bi-Bi al azar E + A <==> EA + B <==> EAB <=> EPQ <==> EQ + P <==> E + Q Bi-Bi ordenado
  11. 11. Utilicemos ahora la simbología o nomenclatura de Cleland: Bi-Bi al azar E E A B EA B A EB EAB Q QP P EP EQ EBA EPQ EQP Bi-Bi ordenada E EEA EAB A B EQ P Q EPQ
  12. 12. E EEA A B EQ P Q - Un caso especial, es el siguiente: - Este mecanismo se conoce como “Mecanismo de Theorell-Chance”, y en realidad es un mecanismo Bi-Bi ordenado, para el que no existe el complejo ternario EAB ni EPQ La alcohol deshidrogenasa es una metaloenzima tetrámeroque contiene zinc en el centro activo y que cataliza la oxidación de etanol) por el coenzima nicotinamina adenina dinuclótido (NAD+) produciendo NADH y acetaldehido
  13. 13. B) Mecanismo “ping-pong” o de doble desplazamiento E + A <=> EA <=> E + P +B <=> EB <=>EQ <==> E + Q - Este tipo de mecanismo es muy común en las reacciones en las que un grupo químico se transfiere desde el sustrato A al B, es decir en reacciones de transferencias. En este tipo de mecanismo, tras la unión del primer sustrato se libera uno de los productos, en una reacción parcial en la que se genera una forma modificada de la enzima. (acil enzimas, fosforil enzimas) Esta forma une al siguiente sustrato, catalizando la formación del segundo producto con regeneración de la forma nativa de la enzima.
  14. 14. * Utilizando la simbología de Cleland, en el caso de reacciones Ping-Pong, tenemos: E EEA E A P EB B Q Uni-Uni-Uni-Uni Ping-Pong, o tetra-Uni Ping Pong
  15. 15. ¿De acuerdo con la nomenclatura de Cleland, cómo nombraría la siguiente reacción? EE Succinil-CoA HSCoA Pi Succinato GDP GTP Succinil-E E-P
  16. 16. 4. Cálculo de la ecuación de velocidad de reacción: Ecuaciones con dos substratos Las condiciones de partida para derivar la ecuación de velocidad con dos o más sustratos son las mismas que hemos utilizados para la derivación de la ecuación de velocidad en un sistema sencillo: S --> P a) Supondremos la formación de un equilibrio rápido: entre la E y los S b) La ec. de conservación nos dice que (Eo) = al sumatorio de todas las especies químicas en las que pueda encontrarse la enzima: (Eo) = (EXi) c) Supondremos la existencia de condiciones de estado estacionario
  17. 17. 4.1 Mecanismo Secuencial Bi Bi al azar. B A E + P+ Q v = kcat [EAB=EBA]                              EABEBEAEE EBA BEB K EAB BEA K EB BE K EA AE K T MM BA BAAB    AB BA M M B A K K K K  A + B P +Q E A B EA EB EAB kcat KA KB KM AB KM BA EBA KM es la concentración de Substrato en el cual v=1/2 Vmax cuando el otro substrato está saturante
  18. 18. E A B EA EB EAB kcatKA KB KM AB KM BA EBA                                       AMBA T T AM M M KK BA E K B E K A EEE EABEBEAEE KK BA EEAB K BEA EAB EAB BEA K AB AB AB AB ][ ][      E + P+ Q      AB MAKK BA Ekcatv           BAKBKAKK BA Ekcatv BAABAB MMMA T       Ecuación de velocidad para un mecanismo secuencial al azar v = kcat [EAB]
  19. 19.          BAKBKAKK BA Ekcatv BAABAB MMMA T              BAKBKAKK BA Vv BAABAB MMMA       max Vmax = kcat [ET] Concentraciones saturante de A y B ECUACIÓN DE VELOCIDAD PARA Mecanismo Secuencial Bi Bi al azar
  20. 20.        BAKBKAKK BA Vv BAABAB MMMA       max Constante [A]                          AK AKK K AK AV V BA AB BA M AM M ´ max ´max Un substrato constante pero no saturante Ver anexo 1    BK B Vv   ´ ´max
  21. 21. Igual se hace para [B] constante pero no saturante        BAKBKAKK BA Vv BAABAB MMMA       max    AK A Vv   ´ ´max                          BK BKK K BK BV V AB BA AB M BM M ´ max ´max Constante [B]
  22. 22. [A] Vmax V`max KM BA         AK AV V BA M max ´max                  AK AKK K BA AB M AM ´ K` [A] KB KM AB Representación gráfica: Obtención de las constantes cinéticas [A] =0 [B] Vmax V`max KM AB         BK BV V AB M max ´max K` [B] KA KM BA                  BK BKBK K AB BA M M ´    AK A Vv   ´ ´max    BK B Vv   ´ ´max [A] cte [B] cte
  23. 23.                          AK AKK K BK BV V BA AB BA M AM M ´ max ´max [B] se hace muy grande, -->  , condición de saturación Comportamiento queda reducido a las expresiones de Michalis-Menten Análisis de la ecuación: Un substrato constante y saturante        BAKBKAKK BA Vv BAABAB MMMA       max    AK A Vv AB M   max   AB AB M M K A AK K V B BV V                     ´ max max ´max [B] Muy grande
  24. 24. [A] se hace muy grande, -->  , condición de saturación Comportamiento queda reducido a las expresiones de Michalis-Menten Análisis de la ecuación: Un substrato constante y saturante        BAKBKAKK BA Vv BAABAB MMMA       max    BK B Vv BA M   max   BA BA M M K B BK K V A AV V                     ´ max max ´max[A] Muy grande                          BK BKK K AK AV V BA AB BA M AM M ´ max ´max
  25. 25. 4.2. Mecanismo secuencial Bi-Bi ordenado QPEEABBEAAE  KA KmAB kcat                  EABEAEE EAB BEA Km EA AE K T AB A    v        BAKAKK BA Ekcatv ABAB MMA T       V=kcat[EAB]      BAKAKK BA Vv ABAB MMA       max
  26. 26. Constante B      BAKAKK BA Vv ABAB MMA       max               BK KK K BK BV V AB AB AB M MA M ` max `max Determinar K`y V`max a diferentes concentraciones de B [B] Vmax    AK A Vv   ` `max V`max Regresión No-linear Vmax KM AB K` [B] KA
  27. 27. Constante A      BAKAKK BA Vv ABAB MMA       max    BK B Vv   ` `max AB AB M MA K A KK K VV   ` max`max K` KM AB [A] Pendiente es igual: KA KAB ORDEN DE UNÓN DE SUBSTRATOS EN UN MECANISMO BIBI ORDENADO: Cálculo de la Velocidad máxima haciendo constante un substrato: Una relación de substrato concentración idependiente frente a valor de Vmax indica que es el primer substrato que se une a la enzima
  28. 28. 4.3. Mecanismo Bi Bi Ping-Pong No hay complejo ternario k1 k2 k3 k4 E +A EA P + E* + B E*B E + Q k -1 k-3 O con la nomenclatura de Cleland: E EEA E* A P E*B B Q - Consideraremos velocidades iniciales unidireccionales. KM A KM B
  29. 29. k1 k2 k3 k4 E +A EA P + E* + B E*B E + Q k -1 k-3 KM A KM B La velocidad de reacción es la descomposición del complejo EB v = k4 [E*B]                    BEEEAEE BE BE k kk K EA AE k kk K T B M A M ** ´ * 3 43 1 21          Las constantes de Michaelis y el balance de masas en el estado estacionario 4kkcat 
  30. 30.                        2 4 2 4 1 max k k BAAKBK k k BAV v B M A M Despejando [E*B]de las ecuaciones anteriores ECUACIÓN DE VELOCIDAD EN MECANISMO BI BI PING PONG 2 4 42 4 k k kk kkcat              BAAKBK BAV v B M A M    max Paso limitante
  31. 31. Constante B      BAAKBK BA Vv BAAB MM           max                   BK BK K BK BV V B A B M M M  ` max `max Determinar K`y V`max a diferentes concentraciones de B [B] Vmax    AK A Vv   ` `max V`max Regresión No-linear Vmax KM B K` [B] KM B KM A KM B
  32. 32. Constante A    AK A Vv   ` `max        AK AK K AK AV V A B A M M M       ` max `max      BAAKBK BA Vv BAAB MM           max [B] Vmax V`max K` KM A KM B KM A Regresión No-linear Vmax KM A
  33. 33. DIFERENCIACIÓN MECANISMOS [B] K` Ping-Pong Ordenada Al azar K` Ping-Pong Ordenada Al azar [A]
  34. 34. Mecanismo Enzima Bi-Bi al azar Adenilato quinasa (EC 2.2.4.3) Creatin quinasa (EC 2.7.3.2) Citrato sintasa (EC 4.1.3.7) Bi-Bi ordenado Alcohol deshidrogenasa (EC 1.1.1.1) Malato deshidrogenasa (EC 1.1.1.37) Ribitol deshidrogenasa (EC 1.1.1.56) Lactato deshidrogenasa (EC1.1.1.27) Bi-Bi Ping Pong Coenzima-A transferasa (EC 2.7.8.7) Glutamato-alanina transaminasa (EC 2.6.1.2) Glucosa oxidasa (EC 1.1.3.4)
  35. 35. Inhibición por productos Diferentes tipos de inhibición por producto en las reacciones que transcurren con dos substratos y dos productos Mecanismo Inhibidor Substrato A (B saturante) Substrato B (A saturante) Bi-Bi ordenado P Q Acompetitiva Competitiva No competiva ------------------ Ping Pong P Q Competitiva ----------------- ------------------ Competitiva Bi-Bi al azar P Q No competitiva No Competitiva No competitiva No competitiva A + B --- P + Q
  36. 36. RESUMEN Los conceptos utilizados para la obtención de datos cinéticos en reacciones monosubstratos ,son útiles para el estudio de las reacciones más complejas, con más de un substrato y más de un producto de reacción, si se hace depender la reacción de un solo reactante y los demás permanecen a concentraciones saturantes, es decir, la reacción será de orden cero con respecto a todos los reactantes menos uno. En el caso de reacciones bisustratos puede distinguirse si la reacción tiene lugar mediante un complejo ternario, o si el enzima queda modificado al reaccionar con el primer substrato (mecanismo Ping Pong). En el caso de formación de un complejo ternario puede obtnerse al azar (mecanismo BiBi al azar) o de manera ordenada (mecanismo Bi-Bi ordenado). Se han deducido la s ecuaciones de velocidad y la forma de obtener las constantes cinéticas que describen el proceso enzimático. La inhibición por los productos P y Q puede servir para discriminar mecanismos probables de reacción. En general la información cinética puede ayudarnos para comprender propiedades locales de las enzimas, necesarias parea entender el control de la actividad enzimática y el papel de una enzima en el proceso de metabolismo celular.
  37. 37. Anexo 1        BAKBKAKK BA Vv BAABAB MMMA       max A constante                                             B AK AKK B AK V v B AK KAKK B AK V v AK BAKKAKK B AK V v AK BAKBKAKK B AK V v BAKBKAKK BA Vv BA ABBA BA ABABBA BA BAABABBA BA BAABABBA BAABAB M AMM M MMAM M MMMAM M MMMAM MMMA                                      )( max max )( max max max                          AK AKK K AK AV V BA AB BA M AM M ´ max ´max Se divide    BK B Vv   ´ ´max
  38. 38. PROBLEMAS. 1. Una enzima cataliza la siguiente reacción de la forma AX +B Bx + A Fue investigada a temperatura, pH y concentración de enzima constante dejando constante la concentración de B, y variando la concentración de substrato AX. Los resultados obtenidos. INICIAL [AX] [B]=2.0mM 4.0 mM 6.0 mM 2.0 250 286 300 2.5 278 323 341 3.3 313 371 395 5.0 357 435 469 10.0 417 526 577 ¿Qué tipo de mecanismo cursa esta reacción bisustrato?

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