Conferencia XI CNEQF Cartagena 2010.

1. Alexis Labrada, PhD
Centro Nacional de Biopreparados (BIOCEN)
La Habana, Cuba

2. 2
 > 900 trabajadores, 5 plantas de
producción
 I+D y fabricación de
biofarmacéuticos:
◦ Formulación aséptica de vacunas (HepB,
Hib, Penta)
◦ Proteínas recombinantes (Estreptokinasa,
GCSF)
◦ Biológicos naturales (alergénicos,
inmunomoduladores, antianémicos)
◦ Liofilización
BIOCEN: complejo científico-industrial
(Polo Biotecnológico de La Habana)
Experiencia personal:
 18 años en I+D, Director Proyecto, vacunas terapéuticas alergénicas
 Biología molecular, inmunología, alergología
 Desarrollo farmacéutico, estudios preclínicos y clínicos
 Registro de las primeras vacunas alergénicas en Cuba

3. 3

4. 4
 Instituciones a “ciclo completo”: Investigación-Producción-
Comercialización
 Concentración en áreas de fortaleza:
 Vacunas, adyuvantes
 Proteínas recombinantes, procesos biotecnológicos
 Ac monoclonales
 Productos naturales
 Neurociencias
 Desarrollo de recursos humanos propios
 Asimilación de tecnologías de avanzada
 Biología molecular, genómica, proteómica, bioinformática, nanotecnologías
 Enfocado hacia aplicaciones en la salud, encargo social
 Política de Calidad y desarrollo de ambiente regulatorio

5.  Fuente: Oficina Nacional de Estadísticas www.one.cu
5
116,2 110,3
130,8 123,7 112,5
152,9
0
100
200
300
400
500
600
700
800
900
2003 2004 2005 2006 2007 2008
%
Crecimientode la industria farmacéuticacubana
Dinámica medicamentos humanos (%)
Prod.física de farmacéuticos y botánicos (1989=100%)
minería
39%
farmacéuticos
10%
ind. azucarera
6%
industria
del tabaco
7%
pesca
2%
agropecuarios
0%
otros
36%
Exportacionescubanas 2008

6. 6

7. 7
 Productos
biofarmacéuticos
◦ Proteínas/polipéptidos y
sus derivados
 Vacunas (profilácticas)
 Vacunas terapéuticas
◦ Cáncer
◦ Alergia
◦ Infecciones (HepB, SIDA)
◦ Autoinmunidad
 Por su tecnología:
◦ Biológicos (fuentes
naturales)
◦ Biotecnológicos
(ADN recombinante)
 Bacterias y levaduras
(Vacuna HepB, GCSF)
 Células superiores
(Ac. Monoclonales)

8.  Vacuna (profiláctica = prevención)
◦ Inducción de respuesta inmune protectora
 Vacuna terapéutica (tratamiento)
◦ Modificación de respuesta inmune (efectiva contra la
enfermedad)
 Elemento común: acción sobre inmunidad
adaptativa (antígeno-específica),
◦ Anticuerpos
◦ Respuesta celular
◦ Memoria inmunológica (efecto perdurable)
Clave: - Adyuvantes, “delivery systems”, formulaciones
- Investigación básica (inmunología)

9. Vacunas
Medicamentos
Vacunas
terapéuticas
- Inmunología
- Tecnología
(biológicos)
Evaluación
clínica

10. Citocinas, interferones
GCSF, TNF, EGF
t-PA , Estreptokinasa
Eritropoietina
Hormona de crecimiento
Insulina
Etc.
Vacunas
• Tradicionales:
• Bacterias, células completas,
• Inactivadas, atenuadas
• Virales
• Subunidades
• Purificadas
• Recombinantes
• Sintéticas (polisacáridos,
péptidos)
Alergénicos
• Diagnóstico in-vivo
• Tratamiento (vac. terapéutica)
Vacunas terapéuticas (Cáncer)
Inmunoterapia pasiva
• Antisueros
• Anticuerpos monoclonales
• Diagnóstico in-vivo
• Tratamiento
Inmunomoduladores naturales
Hemoderivados (plasma)

11.  Biomoléculas (alto peso molecular 5-200KDa, estructura compleja,
procesos biológicos)
 Heterogeneidad y variabilidad en su estructura
◦ variantes aa, glicosilación, interacciones con el medio
◦ aún mayor para productos naturales con múltiples moléculas (vacunas)
 Inmunogenicidad
◦ Deseable en vacunas
◦ No deseable en otros biofarmacéuticos
 Degradación (condiciones de conservación, formulaciones estables)
 Proceso productivo más complejo y variable
 Concepto de actividad biológica
 Enfoque regulatorio específico
 Nuevos “propietarios”
 ¿Genéricos?
 “Biosimilares”

12. Investigación
básica
(descubrimiento/inven
ción)
• Biología Molecular
• Inmunología
• Farmacología
Desarrollo
• Farmacéutico
•Procesos fabricación
•Formulación
•Analítico
•Estabilidad
• No clínico
•Toxicología
•Farmacología
• Ensayos Clínicos
• REGISTRO
Producción
•Mejora continua
•Cambios
•Estabilidad continuada
•Desarrollo clínico post-
comercialización

13.  Escalas de laboratorio (centros de investigación, universidades)
 Salidas:
◦ Caracterización de la(s) molécula(s);
 Actividad biológica
 Estructura, secuencia aa /ADN (identidad)
 Funcionalidad (inmunogenicidad) en modelos animales o in-vitro, prueba de
concepto
◦ Métodos preliminares de obtención
 Sistema de expresión (rec)
 Banco celular (bacterias, levaduras, hibridomas, células superiores)
 Extracción y purificación
◦ Propiedad Intelectual, Patente (transferencia tecnológica)
 ¿GLP?, ¿GMP?
 Análisis preliminar de factibilidad
económica/comercial/regulatoria

14. Desarrollo de procesos
- Escalado/adaptación a
tecnologías industriales GMP
- Ingrediente activo
- Formulación (prod. terminado)
- Consistencia
- Producción lotes GMP
Desarrollo analítico
- Métodos específicos
- Métodos de Farmacopea
- Materiales de Referencia
Validación
Evaluación preclínica
(no clínica)
Toxicidad, Farmacocinética
Farmacodinámica
(inmunogenicidad y protección)
Validación
Transferencia
(introducción)
Mejora continua
Consistencia
Transferencia
(introducción)
Mejora continua
F I F II F III
Estudios de Estabilidad (tiempo real)
- Ingrediente activo
- Producto terminado
Registro
GMP

15. 0
20
40
60
80
100
Escala productiva
Validación Proc. Asépticos
Validación Procesos IFA
Validación Métodos Analíticos
 EMEA CHMP/QWP/185401/2004 “GUIDELINE ON THE REQUIREMENTS TO
THE CHEMICAL AND PHARMACEUTICAL QUALITY DOCUMENTATION
CONCERNING INVESTIGATIONAL MEDICINAL PRODUCTS IN CLINICAL TRIALS
GLP

16. F I F II F III
 Características física s, químicas y
biológicas.
IFA
Banco de células
Actividad biológica
Secuencia aa
IFA
IFA
Estructura terciaria
Perfil glicosilación, etc
 Composición cualitativa y cuantitativa. PFT PFT PFT
 Especificaciones.
I FA (exc. perfil
impurezas)
PFT
IFA (exc. perfil de
impurezas)
PFT
IFA
PFT
 Validación de métodos analíticos. Posible Posible IFA y PFT
 Descripción del proceso de fabricación
IFA: preliminar, (incl..
remoción de virus)
PFT
IFA: (incl.. estabilidad
celular)
PFT
IFA
PFT
 Preparación de referencia
IFA
Actividad biológica
 Descripción del sistema de cierre -
envase contenedor
PFT IFA y PFT IFA y PFT
 Certificados Analíticos IFA y PFT IFA y PFT IFA y PFT
 Estabilidad PFT, 6 meses
IFA
PFT: 3 lotes, 6 meses
IFA
PFT: 3 lotes pilotos, 12
meses
Reg. No. 21 - 2008 CECMED. REQUISITOS PARA LA AUTORIZACIÓN Y MODIFICACIÓN DE
ENSAYOS CLÍNICOS (www.cecmed.sld.cu)
Información Químico-Farmacéutica y Biológica (Parte II)

17.  Estabilidad
◦ Q1A(R2) Stability Testing of New Drug Substances and Products
 Validación analítica
◦ Q2(R1) Validation of Analytical Procedures: Text and Methodology
 Calidad de los productos
◦ Q5A(R1) Viral Safety Evaluation of Biotechnology Products Derived from Cell Lines of Human or
Animal Origin
◦ Q5B Quality of Biotechnological Products : Analysis of the Expression Construct in Cells Used for
Production of r-DNA Derived Protein Products
◦ Q5C Quality of Biotechnological Products : Stability Testing of Biotechnological/Biological Products
◦ Q5D Derivation and Characterisation of Cell Substrates Used for Production of
Biotechnological/Biological Products
◦ Q5E Comparability of Biotechnological/Biological Products Subject to Changes in their
Manufacturing Process
 Especificaciones
◦ Q6B Specifications : Test Procedures and Acceptance Criteria for Biotechnological/Biological
Products
 GMP
◦ Q7 Good Manufacturing Practice Guide for Active Pharmaceutical Ingredients

18.  Especificación: lista de parámetros de calidad, límites y métodos
de ensayo
 Persigue describir y confirmar la calidad del producto, no su
completa caracterización
 Propiedades moleculares y biológicas de mayor pertinencia para
la:
◦ Seguridad
◦ Eficacia
 Aplicable a:
◦ Materiales de partida y productos intermedios
◦ Sustancia activa (ingrediente activo)
◦ Producto terminado
 Estrecha relación con el proceso productivo, la evaluación no
clínica y clínica
ICH Q6B Specifications : Test Procedures and Acceptance Criteria for
Biotechnological/Biological Products

19. Ingrediente activo
 Apariencia y descripción
 Identidad
◦ Combinación ensayos FQ
e IQ
 Pureza e impurezas (de
proceso)
 Potencia (actividad
biológica)
 Cantidad (masa)
Producto terminado
Además de las del IFA:
 Pruebas generales
(Farmacopeas):
 Esterilidad/Límite
microbiano
 Endotoxinas en
inyectables
 Materia particulada en
inyectables
 Uniformidad
 Humedad en liofilizados

20.  Actividad biológica:
◦ Atributo imprescindible para productos biológicos (imposibilidad técnica
de determinar estructura molecular en cada lote)
◦ Funcionalidad (conservación de estructura terciaria)
◦ Relevante para la eficacia (o seguridad)
 Potencia: (expresada en unidades): Medida cuantitativa de la actividad biológica
 Cantidad o contenido (masa): medición físico-química.
Métodos in-vitro (ex-vivo)
• Celulares: respuesta
bioquímica o fisiológica
• Bioquímicos
Ej. actividad enzimática
• Reacciones ligando-receptor
Inmunoensayos
Ej. ELISA de competencia
Métodos in vivo (bioensayos)
• En modelos animales: respuesta
del organismo
Ej. Inmunogenicidad de vacunas
• En humanos
Ej. Actividad alergénica por
prueba de punción en vacunas
de alergenos, para referencias

22.  Selección de “metámetros”
 Función dosis-respuesta
 Precisión (variabilidad intrínseca)
 Método estadístico de las rectas paralelas
Potencia relativa
Conc.
señal
Compara la función de respuesta
con respecto a un referencia
• mayor especificidad
• mayor precisión

23. Curva Dosis-Respuesta
-20%
0%
20%
40%
60%
80%
100%
120%
0.1 1 10 100 1000 10000
Potencia (UB/mL)
Inhibición(%)
DPT
DPT re
DSB
DSB re
BLT
BLT re
Log(Potencia relativa): Distancia horizontal con respecto a la RI

24. 0.53 -1.87Intradermal parallel test (ID50 EAL) [5]
Method Precision (CI95%)
Parallel Skin Prick Test
(σ = 0.103)
0.628 - 1.594
IgE Inhibition ELISA (BIOCEN) 0.60-1,66
SPT Test Histamine standard 10 mg/mL
(Nordic Guidelines) [7]
~ 0.3 – 3.0
0.53 -1.87Intradermal parallel test (ID50 EAL) [5]
Method Precision (CI95%)
Parallel Skin Prick Test
(σ = 0.103)
0.628 - 1.594
IgE Inhibition ELISA (BIOCEN) 0.60-1,66
SPT Test Histamine standard 10 mg/mL
(Nordic Guidelines) [7]
~ 0.3 – 3.0
A method for relative potency determination of new In-House
Reference batches of allergen products, by parallel Skin Prick Test
AAlexis Labrada, Yunia Oliva, Maytee Mateo, Raúl L Castro, Arelis Más, Bárbara Navarro*
Allergens Dept., National Center of Bioproducts (BIOCEN), Havana, Cuba
(*) Poly-clinic Capdevila, Boyeros, Havana, Cuba
e-mail: labrada@biocen.cu
AllergenVaccines 2009
Varadero, Cuba

25.  Marcadores de actividad biológica
 Ensayos de contenido de proteínas o antígenos
 Ejemplo:
◦ Contenido Der s 1/Der p 1 (alergenos de ácaros) por ELISA-MAb
◦ Correlación con la actividad alergénica total (in-vivo)
r = 0,88
N= 9, p= 0,002

26.  Contenido de proteína(s)
 Electroforesis
◦ SDS-PAGE
◦ IEF
◦ Electroforesis capilar
 Cromatográficos
◦ HPLC
 Estructura
◦ Mapeo peptídico
◦ Espectrometría de Masa (PM)
◦ Secuencia N-terminal aa
◦ Espectrometría (Dicroísmo circular)

27.  Electroforesis (SDS-PAGE): peso molecular
 Isoelectroenfoque (IEF): punto isoeléctrico
◦ “Isoformas”

28. Perfil de PM de las proteínas del extracto alergénico de Blomia
tropicalis. SDS-PAGE en condiciones reductoras

29.  Western Blotting IgE (perfil alergénico) como ensayo
semicuantitativo
29
SDS-PAGE
Inmunodetección
IgE sérica
Anti IgE
marcada
Análisis densitométrico
Metámetro: Altura de los picos
N

30.  Asegurar que un procedimiento analítico dará
resultados reproducibles y confiables
 Validación prospectiva con criterios de
aceptación pre-establecidos, en una serie de
ensayos

31. Identificación Impurezas Contenido/
Potencia
Cuant. Límite
Exactitud - + - +
Precisión
- Repetibilidad
- Precisión intermedia
/Reproducibilidad
-
-
+
+
-
-
+
+
Especificidad + + + +
Límite de
detección/cuantificación
- + + -
Linealidad - + - +
Rango - + - +
ROBUSTEZ: debe ser considerado en la fase de desarrollo

32. Impreciso pero exacto Preciso pero inexacto

33. ELISA
inhibición IgE
n=65
WB IgE
(Intensidad)
n=21
ELISA-AcM
Der s 1
n=12
ELISA-AcP
Grupo 1
n=12
IC95% 60 -166% 24% 31%
Der s 1: 13%
Der p 1: 17%
33
Ej. aplicados para productos alergénicos en BIOCEN
(resultados de los estudios de validación)

34. 0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
0 1 10 100 1000
Concentración de Der p1 (ng/ml)
D.O.450nm
Rango lineal
Y = m • Log ( x) + n
Bioensayos: generalmente no lineales
Ej. ELISA

35.  Sensibilidad analítica (Límite de cuantificación)
35
Assay range
ELISA-MAb Der s 1
ELISA-MAb Der p 1
ELISA-PolyAb Der s 1
ELISA-PolyAb Der p 1
ELISA
IgE
DS/DP
W
B
IgE
1
10
100
1000
10000
1
10
100
1000
10000
35
25
16
30
1616
AllergenicPotencyBU/mL
Allergencontent,ng/mL
AllergenVaccines 2009
Varadero, Cuba

36.  Indispensables en productos biológicos
 Comparación en ensayos de actividad
biológica y FQ
 Sistema de Unidades (Internacionales)
 Requisitos:
◦ Homogeneidad
◦ Caracterización (+ que para los lotes de producción)
◦ Estabilidad (usualmente liofilizados)
 Estudios acelerados
◦ Trazabilidad (MR secundarios)

37. MR biológicos
 Definen al analito
 Unidades de actividad
(arbitrarias o por definición
según ensayo)
 No requieren ser puros
 El lote de reemplazo no
es idéntico al anterior
¿trazabilidad?
MR químicos
 Caracterización F-Q
completa
 Unidades de masa (SI)
 Alta pureza
 Completa trazabilidad

38. Banco celular
Inóculo
Fermentación/
Cultivo
Cosecha
•Cuerpos de inclusión
(precipitación/resolubilización)
•Sistemas de expresión solubles
Purificación
•Cromatografías líquida (IE, HIC,
gel-filtración)
• Afinidad (MAb)
•Ultrafiltración
Esterilización (filtración)
“Upstream”
“Downstream”
Colección de
material de partida
Extracción
GMP

39.  Fermentadores 2000L
 Planta de Ingredientes Activos BIOCEN
 Centrífugas de flujo continuo

40.  Variabilidad intrínseca
Comparación
Biológicos Químicos
PM, Kda 5-200
(± 1)
0.05-2
(± 0.01)
Registros de lote > 250 <10
Ensayos > 2000 < 100
Puntos críticos > 5000 < 100
Datos de proceso > 60 000 <4000

41.  Análisis de Riesgo (ICH Q9 Quality Risk Management)
 Capacidad de proceso: estimación estadística de la
probabilidad de fallos
 Capacidad de proceso:
• Productos químicos > 99 %
• Productos biológicos ~95%
Gráfico de control, Potencia alergénica
VALERGEN, 28 lotes consecutivos
4.5
4.6
4.7
4.8
4.9
5
5.1
5.2
5.3
5.4
5.5
5.6
0 5 10 15 20 25
Mean
log(p) Mean Control limits
Specification Low er limit Upper limit
Variabilidad total
Variabilidad
proceso
43%Error
analítico
57%
σ = 0,099

42.  Contaminación biológica
◦ Microbiológica
◦ Endotoxinas
◦ Proveniente del hospedero (ADN, proteínas)
◦ Virus
 Banco celular
 Sustratos (medios de cultivo de origen animal o humano)
 Columnas de inmunoafinidad
 Excipientes (Albúmina humana)
 Necesidad de procesos de inactivación/remoción de virus
 Modificación/degradación del producto
◦ Intrínseca (banco de células)
◦ provocada por el proceso
 ICH Q5A Quality of Biotechnological Products: Viral Safety Evaluation of Biotechnology
Products Derived from Cell Lines of Human or Animal Origin
 ICH Q5D Derivation and Characterisation of Cell Substrates Used for Production of
Biotechnological/Biological Products

43. Producción de AcM

44.  Actividad biológica (específica)
Modificaciones estructurales Herramientas analíticas físico-químicas
Truncado SE HPLC, SDS-PAGE, AUC, mapeo de péptidos con MS,
RP HPLC
Alteraciones en la glicosilación Electroforesis Capilar, LC-MS, MS, MALDI-TOF
Isomerización RP HPLC
Agregación SE-HPLC, electroforesis, AUC
Oxidación mapeo de péptidos con MS
Deamidación cIEF, mapeo de péptidos con MS, CEX-HPLC
Plegamiento incorrecto RP-HPLC, NMR
Impurezas específicas Herramientas analíticas
Proteínas del hospedero ELISA (Ac policlonales)
Proteínas del proceso de purificación
(anticuerpos, Proteína A)
ELISA, SDS-PAGE
ADN del hospedero Hibridización
Endotoxinas LAL

45. Formulación Aséptica
•Excipientes
•Vacunas:
•Antígeno(s)
•Adyuvante (adsorción
en gel de Hidróxido de
Aluminio)
Llenado aséptico
Sistema automático de formulación aséptica,
Planta de Parenterales No. 2 BIOCEN
Liofilización
Usifroid
SMH-100
BIOCEN

46.  Secado por medio de sublimación
(del estado congelado sólido a
vapor)
 Útil para sustancias termolábiles
(proteínas)
 Ventajas:
◦ Estabilidad
◦ Flexibilidad en la reconstitución del
producto (volumen) y diferentes
presentaciones.

48.  Receta: parámetros de temperatura y
presión, en las diferentes etapas
 Formulación apropiada:
agentes de carga, excipientes
 Humedad de los tapones
 Sistema CIP/Esterilización
 Controles de calidad:
◦ Forma de la pastilla
◦ Humedad residual
◦ Actividad biológica

49.  Propiedades intrínsecas de los biológicos
◦ Susceptibles a degradación
◦ Termolábiles, generalmente conservados en refrigeración
 Diseño de estudios de estabilidad
◦ Tiempo real
◦ Uso de ensayos de actividad biológica (poca precisión)
◦ IFA y productos intermedios
◦ Producto terminado
 Liofilizados/reconstituidos
 Interacción con contenedor-cierre (posición invertida)
 Estrés
ICH Q5C STABILITY TESTING OF BIOTECHNOLOGICAL/BIOLOGICAL PRODUCTS

50. Métodos analíticos principales
(indicativos de estabilidad)
 Físico-químicos
(alteraciones del peso molecular,
carga, hidrofobicidad)
◦ Perfiles electroforesis: SDS-PAGE,
IEF
◦ Cromatográficos: HPLC (RP, IEC, gel
filtración)
◦ Modificaciones estructurales:
dicroísmo circular, mapeo
péptídico.
 Indicativos de actividad biológica
◦ Bioquímicos
◦ Inmunoquímicos: Immunoblotting,
ELISA
Mecanismos de degradación
de las proteínas en
conservación
 Oxidación
 Deamidación
 Agregación
 Fragmentación (hidrólisis,
proteólisis)

51.  3 lotes por producto
0.3
Potencia alergénica total
0 3 6 9 12 15
0.1
1
10
0.3
DS 4°C
DS 37°C
BT 4°C
BT 37°CDP 37°C
18 24 30 36 42 48 54 60 66
DP 4°C
Tiempo (meses)
Potenciarelativa

52. Glic.
Soldatova LN, Paupore EJ, Burk SH, Pastor RW, Slater JE. The stability of house dust mite allergens in
glycerinated extracts. J Allergy Clin Immunol. 2000;105(3):482-8

53.  Tendencias (regresión lineal, semilog, IC95%)
Stability of allergenic potency
0 3 6 9 12
-0.6
-0.4
-0.2
-0.0
0.2
4°C
37°C
60°C
t (months)Log(Rel.Potency)
Medicamento químico Biológico
(Extracto alergénico de
Blomia tropicalis)

54.  ICH Q10 Pharmaceutical System
 ICH Q8 Pharmaceutical Development
 Aplicación de GMP, GLP, GCP
 ISO-9001:2000 Sistemas de gestión de la calidad
◦ Sistema integrado desde “Diseño y Desarrollo”
◦ Certificación

55.  Revisión del diseño y
desarrollo
 Planificación, etapas
 Evaluación:
◦ “Verificación:” requisitos de los
elementos de entrada,
comparaciones, controles de
calidad.
◦ “Validación:” capacidad de
satisfacer su uso previsto
 Control de cambios
 Mejora continua
Elementos de entrada en la
I+D
◦ Especificaciones de diseño:
◦ Funcionalidad
◦ Seguridad (ambiental)
◦ Fiabilidad (estabilidad)
◦ Composición/Calidad
Salidas:
◦ Especificaciones de
productos y procesos
◦ Prototipos/productos

56.  ICH Q8
 ICH Q10
• Ingrediente activo
• Formulación y envase primario
• Sistema de entrega
• Procesos y escalado
• Métodos analíticos
Desarrollo Farmacéutico
• Del desarrollo a la producción
• Entre instalaciones
Transferencia de la
tecnología
Producción
Descontinuación
Ciclo de vida del producto:
Soporte al
“espacio de diseño”
“Espacio de Diseño”: combinación de variables de entrada capaz
de garantizar la calidad.
 Las variaciones dentro del “espacio de diseño” no se
consideran “cambios”.

57. Elementos del sistema
de calidad
Desarrollo Transferencia de
la tecnología
Fabricación
Acciones correctivas y
preventivas (CAPA)
La metodología puede
ser útil
Puede ser usado
(mejora continua)
Requerido
Control de cambios
Flexible
Documentación
Trazabilidad
Mayor formalidad
Información a la
gerencia
Estricto
Evaluación (monitoreo) del
desempeño de procesos y
productos
Necesario Necesario Requerido
Revisión gerencial del
desempeño de procesos y
calidad de productos
aspectos
(ISO: Revisión del
diseño)
aspectos
(ISO: Revisión del
diseño)
Sistema estructurado
(mejora continua)
• ICH Q8 y Q10