DIAGNÓSTICO MOLECULAR DE LOS LINFOMAS NO HODGKIN Jerónimo Forteza Vila Jefe de Servicio y Catedrático de Anatomía Patológi...
LINFOMAS 1832 Acuarela Robert Carswell
Classification of lymphoid neoplasms: the microscope as a tool for disease discovery. Jaffe ES, Harris NL, Stein H, Isaacs...
 
 
<ul><li>Datos Clínicos </li></ul><ul><li>Estudio Morfológico </li></ul><ul><li>Estudio Inmunohistoquímico </li></ul><ul><l...
Características moleculares de los linfomas  <ul><li>Diagnóstico </li></ul><ul><li>Pronóstico </li></ul><ul><li>Terapéutic...
Técnicas moleculares en el diagnóstico de linfomas <ul><li>¿Es realmente esencial para el diagnóstico? </li></ul><ul><ul><...
Técnicas moleculares y diagnóstico de linfomas <ul><li>¿Qué cuestiones puede resolver? </li></ul><ul><ul><li>Benignidad vs...
Técnicas moleculares en linfomas <ul><li>Estudios de clonalidad: reordenamientos de genes codificantes de receptores de an...
Reordenamiento de genes codificantes de receptores de antígenos <ul><li>Proceso inmunológico </li></ul><ul><li>Generación ...
Reordenamiento específico de V(D)J para cada clon <ul><li>Policlonal </li></ul><ul><li>Monoclonal </li></ul>
Estudios de clonalidad: Métodos <ul><li>Southern blot: “gold standard” </li></ul><ul><ul><li>Necesita buena calidad de ADN...
FR3 mw M P C- Electroforesis en gel de poliacrilamida
Monoclonal Policlonal Análisis de fragmentos (Electroforesis por capilar) FR3
“ Patrón de puercoespín” Monoclonal Policlonal FR3 Análisis de fragmentos (Electroforesis por capilar)
Reordenamiento en TCR por PCR <ul><li>Cadena TCR gamma </li></ul><ul><li>Cadena TCR beta </li></ul>Electroforesis en gel d...
TCR1 Reordenamiento monoclonal TCR2 Reordenamiento policlonal Reordenamiento monoclonal Reordenamiento policlonal Análisis...
Recidiva vs. Segundo tumor Linfoma de la zona marginal esplénico
Tres años después Adenopatía cervical: LBCG con translocación en MYC
¿Transformación o segundo linfoma? 1ª biopsia  (bazo) 2ª biopsia  (ganglio)
Estudios de clonalidad por PCR: Limitaciones <ul><li>Resultados falso negativos </li></ul><ul><ul><li>Degradación del ADN ...
<ul><li>Resultados falso positivos </li></ul><ul><ul><li>Exceso de sensibilidad </li></ul></ul><ul><ul><li>“ Pseudo-clones...
<ul><li>Reordenamientos clonales tanto de  los genes Ig o TCR no  es equivalente a línea B o T. </li></ul><ul><ul><ul><li>...
<ul><li>¡Monoclonalidad no es sinónimo de malignidad! </li></ul><ul><li>- Inmunodepresión </li></ul><ul><ul><ul><ul><li>- ...
<ul><li>BIOMED-2 </li></ul><ul><ul><li>PCR Multiplex  (estudio de varias regiones en la misma reacción de PCR) </li></ul><...
 
Técnicas inmunohistoquímicas características de alteraciones citogenéticas ALK1 Cyclin D1 Inmunohistoquímica como técnica ...
Técnicas moleculares en linfomas <ul><li>Características de las alteraciones citogenéticas </li></ul>
Anormalidades citogenéticas por FISH <ul><li>¿Porqué es mejor el FISH? </li></ul><ul><li>Aplicaciones en el diagnóstico de...
Ventajas del  FISH <ul><li>No necesita células en cultivo </li></ul><ul><li>Puede aplicarse a extensiones citológicas y te...
Diagn Mol Pathol (2008) 17:59-63
Sondas “Dual-fusion” Patrón normal Núcleo en interfase Cromosomas en metafase
Sondas “Dual-fusion” Patrón normal Núcleo en interfase Cromosomas en metafase
Sondas “Dual-fusion” Translocación recíproca Núcleo en interfase Cromosomas en metafase
Sondas “Dual-fusion” Translocación recíproca Núcleo en interfase Cromosomas en metafase
Sondas “Break-appart” Patrón normal Núcleo en interfase Cromosomas en metafase
Sondas “Break-appart” Translocación recíproca Núcleo en interfase Cromosomas en metafase
Ventajas del FISH “split” <ul><li>Genes implicados en translocaciones con diferentes ‘partners’ (MYC, ALK, BCL6) </li></ul...
Linfoma folicular con translocación en BCL2 (sonda ‘break-apart’)
Linfoma folicular Bcl2 positivo
Ausencia de translocación en Bcl2 – Sonda ‘break-apart’
Linfoma folicular Bcl2 negativo
Translocación en BCL2 <ul><li>90 % de los linfomas foliculares </li></ul><ul><li>30% de los linfomas B difusos de célula g...
t(14;18) implicando al gen  BCL2 PCR MBR PCR MBR+MCR FISH 100% 50% 30-40%
FISH - BCL2: utilidad <ul><li>Hiperplasia folicular vs. Linfoma </li></ul><ul><li>Linfoma folicular vs. Otros linfomas de ...
t(11;14) <ul><li>Linfoma del manto </li></ul><ul><li>Cr. 11: gen Ciclina D1 </li></ul><ul><li>Cr. 14: gen IgH </li></ul>PC...
Linfoma del manto: Sonda ‘dual-fusion’ para t(11;14)
Linfoma del manto Ciclina D1 positivo
FISH – CCND1: utilidad <ul><li>Linfoma del manto </li></ul><ul><ul><li>Cuando hay problemas con la inmunotinción de la Cic...
Sangre periférica CD22 TRICOLEUCEMIA - Pancitopenia - Aspirado seco - Marcada esplenomegalia - No hay adenopatías B. Falli...
FISH – Translocaciones en MALT1 <ul><li>Pronóstico (Linfoma MALT gástrico) </li></ul><ul><ul><li>No respuesta a los antibi...
Isaacson and Spencer Histopathology 1987 Linfoma MALT “ Discovery diseases. MALT lymphoma as a paradigm” Jaffe ES, et al. ...
Marshall BJ  y Warren JR (Premios Nobel de Medicina en 2005) Helicobacter Pilory (Warthin-Starry)
Reordenamientos de BCL6 <ul><li>Gen en 3q27 </li></ul><ul><li>Sonda ‘Split’ </li></ul><ul><li>Utilidad: </li></ul><ul><ul>...
Linfoma B de células grandes Bcl6 positivo
Reordenamientos de MYC <ul><li>Característico del Linfoma de Burkitt </li></ul><ul><li>Más frecuente: t(8;14) </li></ul><u...
CD20 BCL6 CD10 HE MIB1 EBER MORFOLOGÍA Y PATRÓN INMUNOHISTOQUÍMICO EN EL LINFOMA DE BURKITT
FISH – Reordenamiento en MYC <ul><li>También útil: </li></ul><ul><ul><li>Como marcador de progresión (Aberración secundari...
BCL-2 MYC FISH
Linfoma B Difuso de Células Grandes con reordenamiento de BCL-2 y MYC (Linfoma de la zona gris)
Translocación en ALK <ul><li>Usualmente los linfomas anaplásicos portan la t(2;5) – ALK/NPM </li></ul><ul><li>Posibilidad ...
<ul><li>Estudios de clonalidad: PCR </li></ul><ul><li>Translocaciones características: FISH </li></ul><ul><li>Material de ...
Dave SS et al.  Molecular diagnosis in Burkitt’s lymphoma . N Engl J Med (2006) 354: 2431-2442
 
<ul><li>Datos Clínicos </li></ul><ul><li>Estudio Morfológico </li></ul><ul><li>Estudio Inmunohistoquímico </li></ul><ul><l...
 
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Diagnostico Molecular De Los Linfomas No Hodgkin

  1. 1. DIAGNÓSTICO MOLECULAR DE LOS LINFOMAS NO HODGKIN Jerónimo Forteza Vila Jefe de Servicio y Catedrático de Anatomía Patológica Hospital Clínico Universitario de Santiago 12 de Enero de 2009 Xátiva (Valencia) BASES MOLECULARES DEL CÁNCER APLICACIÓN A LA PATOLOGÍA TUMORAL
  2. 2. LINFOMAS 1832 Acuarela Robert Carswell
  3. 3. Classification of lymphoid neoplasms: the microscope as a tool for disease discovery. Jaffe ES, Harris NL, Stein H, Isaacson PG. Blood (2008) 112: 4384-4499 Elaine Jaffe Nancy Harris Harald Stein Peter G. Isaacson
  4. 6. <ul><li>Datos Clínicos </li></ul><ul><li>Estudio Morfológico </li></ul><ul><li>Estudio Inmunohistoquímico </li></ul><ul><li>Estudio Molecular </li></ul>DIAGNÓSTICO
  5. 7. Características moleculares de los linfomas <ul><li>Diagnóstico </li></ul><ul><li>Pronóstico </li></ul><ul><li>Terapéutica </li></ul>
  6. 8. Técnicas moleculares en el diagnóstico de linfomas <ul><li>¿Es realmente esencial para el diagnóstico? </li></ul><ul><ul><li>En el 90-95% de los casos, la morfología y el fenotipo son suficientes </li></ul></ul><ul><ul><li>Es esencial para el diagnóstico en el 5-10% de los casos </li></ul></ul>Bcl2 HE Linfoma folicular
  7. 9. Técnicas moleculares y diagnóstico de linfomas <ul><li>¿Qué cuestiones puede resolver? </li></ul><ul><ul><li>Benignidad vs Malignidad (clonalidad) </li></ul></ul><ul><ul><ul><li>Proliferaciones de células B ambiguas </li></ul></ul></ul><ul><ul><ul><li>Linfomas de células T </li></ul></ul></ul><ul><ul><ul><li>Síndromes linfoproliferativos en pacientes inmunocomprometidos </li></ul></ul></ul><ul><ul><li>Recaídas vs segundo linfoma (identidad clonal) </li></ul></ul><ul><ul><li>Tipos específicos de linfomas (translocaciones) </li></ul></ul>
  8. 10. Técnicas moleculares en linfomas <ul><li>Estudios de clonalidad: reordenamientos de genes codificantes de receptores de antígenos </li></ul><ul><li>Translocaciones (“clonality markers”) </li></ul>
  9. 11. Reordenamiento de genes codificantes de receptores de antígenos <ul><li>Proceso inmunológico </li></ul><ul><li>Generación de variabilidad genética para obtener receptores diversos y específicos </li></ul><ul><li>Proceso similar en células B y en T (Ig y TCR) </li></ul>
  10. 12. Reordenamiento específico de V(D)J para cada clon <ul><li>Policlonal </li></ul><ul><li>Monoclonal </li></ul>
  11. 13. Estudios de clonalidad: Métodos <ul><li>Southern blot: “gold standard” </li></ul><ul><ul><li>Necesita buena calidad de ADN (Tejido congelado) </li></ul></ul><ul><ul><li>Muy laborioso </li></ul></ul><ul><ul><li>Necesidad de material reactivo </li></ul></ul><ul><li>PCR: más práctico </li></ul><ul><ul><li>Permite el uso de material fijado en formol e incluido en parafina </li></ul></ul><ul><ul><li>Resultados en dos días </li></ul></ul><ul><ul><li>Más sensible </li></ul></ul>
  12. 14. FR3 mw M P C- Electroforesis en gel de poliacrilamida
  13. 15. Monoclonal Policlonal Análisis de fragmentos (Electroforesis por capilar) FR3
  14. 16. “ Patrón de puercoespín” Monoclonal Policlonal FR3 Análisis de fragmentos (Electroforesis por capilar)
  15. 17. Reordenamiento en TCR por PCR <ul><li>Cadena TCR gamma </li></ul><ul><li>Cadena TCR beta </li></ul>Electroforesis en gel de poliacrilamida P M C (-) PM
  16. 18. TCR1 Reordenamiento monoclonal TCR2 Reordenamiento policlonal Reordenamiento monoclonal Reordenamiento policlonal Análisis de fragmentos
  17. 19. Recidiva vs. Segundo tumor Linfoma de la zona marginal esplénico
  18. 20. Tres años después Adenopatía cervical: LBCG con translocación en MYC
  19. 21. ¿Transformación o segundo linfoma? 1ª biopsia (bazo) 2ª biopsia (ganglio)
  20. 22. Estudios de clonalidad por PCR: Limitaciones <ul><li>Resultados falso negativos </li></ul><ul><ul><li>Degradación del ADN </li></ul></ul><ul><ul><ul><li>Incluir un gen de control interno </li></ul></ul></ul><ul><ul><li>Hipermutación somática del gen IgH </li></ul></ul><ul><ul><ul><li>Linfoma folicular, células plasmáticas neoplásicas </li></ul></ul></ul><ul><ul><li>Abundante población acompañante policlonal </li></ul></ul><ul><ul><li>Reordenamientos inusuales, interferencia con segmentos translocados,… </li></ul></ul>
  21. 23. <ul><li>Resultados falso positivos </li></ul><ul><ul><li>Exceso de sensibilidad </li></ul></ul><ul><ul><li>“ Pseudo-clones”: Pobreza de células diana </li></ul></ul><ul><ul><li>Baja resolución en electroforesis (gel de agarosa) </li></ul></ul><ul><ul><ul><li>Usar poliacrilamida o electroforesis capilar </li></ul></ul></ul>Estudios de clonalidad por PCR: Limitaciones
  22. 24. <ul><li>Reordenamientos clonales tanto de los genes Ig o TCR no es equivalente a línea B o T. </li></ul><ul><ul><ul><li>Infidelidad de linaje (Linfoma linfoblástico) </li></ul></ul></ul><ul><ul><ul><li>Explansión clonal de células B en linfomas T (LAI) o viceversa </li></ul></ul></ul>Estudios de clonalidad por PCR: Limitaciones
  23. 25. <ul><li>¡Monoclonalidad no es sinónimo de malignidad! </li></ul><ul><li>- Inmunodepresión </li></ul><ul><ul><ul><ul><li>- Reacciones hiperinmunes (infecciones virales) </li></ul></ul></ul></ul><ul><ul><ul><ul><li>- Enfermedades autoinmunes </li></ul></ul></ul></ul><ul><ul><ul><ul><li>- Enfermedad de Castleman </li></ul></ul></ul></ul>
  24. 26. <ul><li>BIOMED-2 </li></ul><ul><ul><li>PCR Multiplex (estudio de varias regiones en la misma reacción de PCR) </li></ul></ul><ul><ul><li>Realizable y reproducible </li></ul></ul><ul><ul><li>Linfomas B: 99% monoclonales </li></ul></ul><ul><ul><li>Linfomas T: 94% monoclonales </li></ul></ul><ul><ul><li>Lesiones reactivas: policlonalidad en la gran mayoría </li></ul></ul>Estudios de clonalidad por PCR: Estandarización van Krieken et al. Leukemia (2007) 21: 201-206
  25. 28. Técnicas inmunohistoquímicas características de alteraciones citogenéticas ALK1 Cyclin D1 Inmunohistoquímica como técnica molecular diagnóstica
  26. 29. Técnicas moleculares en linfomas <ul><li>Características de las alteraciones citogenéticas </li></ul>
  27. 30. Anormalidades citogenéticas por FISH <ul><li>¿Porqué es mejor el FISH? </li></ul><ul><li>Aplicaciones en el diagnóstico de los linfomas </li></ul>
  28. 31. Ventajas del FISH <ul><li>No necesita células en cultivo </li></ul><ul><li>Puede aplicarse a extensiones citológicas y tejido fijado en formol e incluido en parafina </li></ul>
  29. 32. Diagn Mol Pathol (2008) 17:59-63
  30. 33. Sondas “Dual-fusion” Patrón normal Núcleo en interfase Cromosomas en metafase
  31. 34. Sondas “Dual-fusion” Patrón normal Núcleo en interfase Cromosomas en metafase
  32. 35. Sondas “Dual-fusion” Translocación recíproca Núcleo en interfase Cromosomas en metafase
  33. 36. Sondas “Dual-fusion” Translocación recíproca Núcleo en interfase Cromosomas en metafase
  34. 37. Sondas “Break-appart” Patrón normal Núcleo en interfase Cromosomas en metafase
  35. 38. Sondas “Break-appart” Translocación recíproca Núcleo en interfase Cromosomas en metafase
  36. 39. Ventajas del FISH “split” <ul><li>Genes implicados en translocaciones con diferentes ‘partners’ (MYC, ALK, BCL6) </li></ul><ul><li>No hay falsos positivos virtualmente </li></ul><ul><ul><li>En contraste, señales de fusión falsas son posibles debido a solapamiento nuclear </li></ul></ul><ul><li>Fácil evaluación </li></ul>
  37. 40. Linfoma folicular con translocación en BCL2 (sonda ‘break-apart’)
  38. 41. Linfoma folicular Bcl2 positivo
  39. 42. Ausencia de translocación en Bcl2 – Sonda ‘break-apart’
  40. 43. Linfoma folicular Bcl2 negativo
  41. 44. Translocación en BCL2 <ul><li>90 % de los linfomas foliculares </li></ul><ul><li>30% de los linfomas B difusos de célula grande </li></ul>1 2 C+ C- PCR Major Breakpoint Region Crom 18 bcl-2 Crom 14 IgH 5’ 3’ MBR
  42. 45. t(14;18) implicando al gen BCL2 PCR MBR PCR MBR+MCR FISH 100% 50% 30-40%
  43. 46. FISH - BCL2: utilidad <ul><li>Hiperplasia folicular vs. Linfoma </li></ul><ul><li>Linfoma folicular vs. Otros linfomas de patrón nodular </li></ul><ul><li>Linfoma B de células grandes: pronóstico (?) </li></ul>
  44. 47. t(11;14) <ul><li>Linfoma del manto </li></ul><ul><li>Cr. 11: gen Ciclina D1 </li></ul><ul><li>Cr. 14: gen IgH </li></ul>PCR en región MTC (“Major Translocation Cluster”) Sólo 50%! C- C+ 3 2 1
  45. 48. Linfoma del manto: Sonda ‘dual-fusion’ para t(11;14)
  46. 49. Linfoma del manto Ciclina D1 positivo
  47. 50. FISH – CCND1: utilidad <ul><li>Linfoma del manto </li></ul><ul><ul><li>Cuando hay problemas con la inmunotinción de la Ciclina D1 (no debería de haberlos) </li></ul></ul><ul><li>Tricoleucemia </li></ul><ul><ul><li>Recordar que la Ciclina D1 puede ser positiva por inmunohistoquímica pero negativa por FISH (clinicopatológicamente es una enfermedad muy distinta) </li></ul></ul>
  48. 51. Sangre periférica CD22 TRICOLEUCEMIA - Pancitopenia - Aspirado seco - Marcada esplenomegalia - No hay adenopatías B. Fallini (2007)
  49. 52. FISH – Translocaciones en MALT1 <ul><li>Pronóstico (Linfoma MALT gástrico) </li></ul><ul><ul><li>No respuesta a los antibióticos </li></ul></ul><ul><ul><li>Probable diseminación </li></ul></ul><ul><li>Detección: algunos RT-PCR; FISH (biopsias endoscópicas) </li></ul><ul><li>Diagnóstico diferencial </li></ul><ul><ul><li>Infiltrados reactivos </li></ul></ul><ul><ul><li>Otros LNH </li></ul></ul>
  50. 53. Isaacson and Spencer Histopathology 1987 Linfoma MALT “ Discovery diseases. MALT lymphoma as a paradigm” Jaffe ES, et al. Classification of lymphoid neoplasms: the microscope as a tool for disease discovery . Blood (2008) 112:4384-4399
  51. 54. Marshall BJ y Warren JR (Premios Nobel de Medicina en 2005) Helicobacter Pilory (Warthin-Starry)
  52. 55. Reordenamientos de BCL6 <ul><li>Gen en 3q27 </li></ul><ul><li>Sonda ‘Split’ </li></ul><ul><li>Utilidad: </li></ul><ul><ul><li>Linfoma B de células grandes (¿pronóstico?) </li></ul></ul>
  53. 56. Linfoma B de células grandes Bcl6 positivo
  54. 57. Reordenamientos de MYC <ul><li>Característico del Linfoma de Burkitt </li></ul><ul><li>Más frecuente: t(8;14) </li></ul><ul><li>‘ Breakpoints’: alta variabilidad (PCR) </li></ul><ul><li>FISH split : lo más útil </li></ul>
  55. 58. CD20 BCL6 CD10 HE MIB1 EBER MORFOLOGÍA Y PATRÓN INMUNOHISTOQUÍMICO EN EL LINFOMA DE BURKITT
  56. 59. FISH – Reordenamiento en MYC <ul><li>También útil: </li></ul><ul><ul><li>Como marcador de progresión (Aberración secundaria) </li></ul></ul><ul><ul><li>Para la detección de LBCG con doble translocación (“double hit”): BCL2 + MYC </li></ul></ul>
  57. 60. BCL-2 MYC FISH
  58. 61. Linfoma B Difuso de Células Grandes con reordenamiento de BCL-2 y MYC (Linfoma de la zona gris)
  59. 62. Translocación en ALK <ul><li>Usualmente los linfomas anaplásicos portan la t(2;5) – ALK/NPM </li></ul><ul><li>Posibilidad de diversos patrones </li></ul>ALK split probe ALK1 “ INMUNOFISH”
  60. 63. <ul><li>Estudios de clonalidad: PCR </li></ul><ul><li>Translocaciones características: FISH </li></ul><ul><li>Material de rutina (Fijado en formol e incluido en parafina) </li></ul><ul><li>Técnicas útiles, pero deben ser interpretadas en el contexto clínicopatológico </li></ul>Técnicas moleculares en el diagnóstico de linfomas no Hodgkin
  61. 64. Dave SS et al. Molecular diagnosis in Burkitt’s lymphoma . N Engl J Med (2006) 354: 2431-2442
  62. 66. <ul><li>Datos Clínicos </li></ul><ul><li>Estudio Morfológico </li></ul><ul><li>Estudio Inmunohistoquímico </li></ul><ul><li>Estudio Molecular </li></ul>DIAGNÓSTICO
  63. 68. Plasmocitoma (HE)
  64. 69. Linfoma de Burkitt
  65. 70. Facultad de Medicina (Universidad de Santiago Gracias por vuestra atención

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