linfona hodgkin

1. BASES MOLECULARES
DEL CÁNCER
APLICACIÓN A LA PATOLOGÍA
TUMORAL
12 de Enero de 2009
Xátiva (Valencia)
DIAGNÓSTICO
MOLECULAR DE LOS
LINFOMAS NO HODGKIN
Jerónimo Forteza Vila
Jefe de Servicio y Catedrático de Anatomía Patológica
Hospital Clínico Universitario de Santiago

2. LINFOMAS
1832
Acuarela
Robert Carswell

3. Classification of lymphoid neoplasms: the microscope as a
tool for disease discovery.
Jaffe ES, Harris NL, Stein H, Isaacson PG.
Blood (2008) 112: 4384-4499
Elaine Jaffe Nancy Harris Harald Stein Peter G. Isaacson

6. DIAGNÓSTICO
• Datos Clínicos
• Estudio Morfológico
• Estudio Inmunohistoquímico
• Estudio Molecular

7. Características moleculares de
los linfomas
• Diagnóstico
• Pronóstico
• Terapéutica

8. Técnicas moleculares en el
diagnóstico de linfomas
• ¿Es realmente esencial para el diagnóstico?
– En el 90-95% de los casos, la morfología y el fenotipo
son suficientes
HE Bcl2
Linfoma folicular
– Es esencial para el diagnóstico en el 5-10% de los casos

9. Técnicas moleculares y diagnóstico
de linfomas
• ¿Qué cuestiones puede resolver?
– Benignidad vs Malignidad (clonalidad)
• Proliferaciones de células B ambiguas
• Linfomas de células T
• Síndromes linfoproliferativos en pacientes
inmunocomprometidos
– Recaídas vs segundo linfoma (identidad clonal)
– Tipos específicos de linfomas (translocaciones)

10. Técnicas moleculares en linfomas
• Estudios de clonalidad: reordenamientos de
genes codificantes de receptores de
antígenos
• Translocaciones (“clonality markers”)

11. Reordenamiento de genes codificantes
de receptores de antígenos
• Proceso inmunológico
• Generación de variabilidad genética para
obtener receptores diversos y específicos
• Proceso similar en células B y en T (Ig y
TCR)

12. Reordenamiento específico de
V(D)J para cada clon
• Policlonal • Monoclonal

13. Estudios de clonalidad: Métodos
• Southern blot: “gold standard”
– Necesita buena calidad de ADN (Tejido
congelado)
– Muy laborioso
– Necesidad de material reactivo
• PCR: más práctico
– Permite el uso de material fijado en formol e
incluido en parafina
– Resultados en dos días
– Más sensible

14. Electroforesis en gel de poliacrilamida
FR3
P M C- mw

15. Análisis de fragmentos
(Electroforesis por capilar)
Monoclonal Policlonal
FR3

16. Análisis de fragmentos
(Electroforesis por capilar)
Monoclonal Policlonal
“Patrón de puercoespín”
FR3

17. Reordenamiento en TCR por PCR
• Cadena TCR gamma
• Cadena TCR beta
Electroforesis en gel de poliacrilamida
P M C (-) PM

18. TCR1
Reordenamiento monoclonal
TCR2
Reordenamiento policlonal
Reordenamiento policlonal
Reordenamiento monoclonal
Análisis de fragmentos

19. Recidiva vs. Segundo tumor
Linfoma de la zona marginal
esplénico

20. Tres años después
Adenopatía cervical: LBCG con translocación en MYC

21. ¿Transformación o segundo linfoma?
1ª biopsia
(bazo)
2ª biopsia
(ganglio)

22. Estudios de clonalidad por PCR:
Limitaciones
• Resultados falso negativos
– Degradación del ADN
• Incluir un gen de control interno
– Hipermutación somática del gen IgH
• Linfoma folicular, células plasmáticas neoplásicas
– Abundante población acompañante policlonal
– Reordenamientos inusuales, interferencia con
segmentos translocados,…

23. Estudios de clonalidad por PCR:
Limitaciones
• Resultados falso positivos
– Exceso de sensibilidad
– “Pseudo-clones”: Pobreza de células diana
– Baja resolución en electroforesis (gel de
agarosa)
• Usar poliacrilamida o electroforesis capilar

24. Estudios de clonalidad por PCR:
Limitaciones
• Reordenamientos clonales tanto de los
genes Ig o TCR no es equivalente a
línea B o T.
• Infidelidad de linaje (Linfoma linfoblástico)
• Explansión clonal de células B en linfomas T
(LAI) o viceversa

25. ¡Monoclonalidad no es
sinónimo de malignidad!
- Inmunodepresión
- Reacciones hiperinmunes (infecciones virales)
- Enfermedades autoinmunes
- Enfermedad de Castleman

26. Estudios de clonalidad por PCR:
Estandarización
• BIOMED-2
– PCR Multiplex (estudio de varias regiones en
la misma reacción de PCR)
– Realizable y reproducible
– Linfomas B: 99% monoclonales
– Linfomas T: 94% monoclonales
– Lesiones reactivas: policlonalidad en la
gran mayoría
van Krieken et al. Leukemia (2007) 21: 201-206

28. Técnicas inmunohistoquímicas
características de alteraciones
citogenéticas
Inmunohistoquímica como técnica
molecular diagnóstica
Cyclin D1 ALK1

29. Técnicas moleculares en linfomas
Características de las alteraciones
citogenéticas

30. Anormalidades citogenéticas por
FISH
• ¿Porqué es mejor el FISH?
• Aplicaciones en el diagnóstico de los
linfomas

31. Ventajas del FISH
• No necesita células en cultivo
• Puede aplicarse a extensiones citológicas y tejido fijado
en formol e incluido en parafina

32. Diagn Mol Pathol (2008) 17:59-63

33. Sondas “Dual-fusion”
Patrón normal
Núcleo en
interfase
Cromosomas en metafase

34. Sondas “Dual-fusion”
Patrón normal
Núcleo en
interfase
Cromosomas en metafase

35. Sondas “Dual-fusion”
Translocación recíproca
Núcleo en
interfase
Cromosomas en metafase

36. Sondas “Dual-fusion”
Translocación recíproca
Núcleo en
interfase
Cromosomas en metafase

37. Sondas “Break-appart”
Patrón normal
Núcleo en
interfase
Cromosomas en metafase

38. Sondas “Break-appart”
Translocación recíproca
Núcleo en
interfase
Cromosomas en metafase

39. Ventajas del FISH “split”
• Genes implicados en translocaciones con
diferentes ‘partners’ (MYC, ALK, BCL6)
• No hay falsos positivos virtualmente
– En contraste, señales de fusión falsas son
posibles debido a solapamiento nuclear
• Fácil evaluación

40. Linfoma folicular con translocación en BCL2 (sonda ‘break-apart’)

41. Linfoma folicular Bcl2 positivo

42. Ausencia de translocación en Bcl2 – Sonda ‘break-apart’

43. Linfoma folicular Bcl2 negativo

44. Translocación en BCL2
• 90 % de los
linfomas
foliculares
• 30% de los
linfomas B
difusos de
célula grande
Crom 18
bcl-2
Crom 14
Major Breakpoint Region
1 2 C+ C-PCR
IgH
5’ MBR 3’

45. t(14;18) implicando al gen BCL2
PCR MBR PCR
MBR+MCR
FISH
100%
50%
30-40%

46. FISH - BCL2: utilidad
• Hiperplasia folicular vs. Linfoma
• Linfoma folicular vs. Otros linfomas de patrón
nodular
• Linfoma B de células grandes: pronóstico (?)

47. t(11;14)
• Linfoma del manto
• Cr. 11: gen Ciclina D1
• Cr. 14: gen IgH
PCR en región MTC
(“Major Translocation Cluster”)
Sólo 50%!
1
2
3
C-C+

48. Linfoma del manto: Sonda ‘dual-fusion’ para t(11;14)

49. Linfoma del manto Ciclina D1 positivo

50. FISH – CCND1: utilidad
• Linfoma del manto
– Cuando hay problemas con la inmunotinción de
la Ciclina D1 (no debería de haberlos)
• Tricoleucemia
– Recordar que la Ciclina D1 puede ser positiva por
inmunohistoquímica pero negativa por FISH
(clinicopatológicamente es una enfermedad muy
distinta)

51. TRICOLEUCEMIA CD22
- Pancitopenia
- Aspirado seco
- Marcada esplenomegalia
- No hay adenopatías
Sangre periférica
B. Fallini (2007)

52. FISH – Translocaciones en
MALT1
• Pronóstico (Linfoma MALT gástrico)
– No respuesta a los antibióticos
– Probable diseminación
• Detección: algunos RT-PCR; FISH (biopsias
endoscópicas)
• Diagnóstico diferencial
– Infiltrados reactivos
– Otros LNH

53. Linfoma MALT
Isaacson and Spencer Histopathology 1987
“Discovery diseases. MALT lymphoma as a paradigm”
Jaffe ES, et al. Classification of lymphoid neoplasms: the microscope as a tool for
disease discovery. Blood (2008) 112:4384-4399

54. Marshall BJ y Warren JR
(Premios Nobel de Medicina en 2005)
Helicobacter Pilory (Warthin-Starry)

55. Reordenamientos de BCL6
• Gen en 3q27
• Sonda ‘Split’
• Utilidad:
– Linfoma B de células grandes
(¿pronóstico?)

56. Linfoma B de células grandes Bcl6 positivo

57. Reordenamientos de MYC
• Característico del Linfoma de Burkitt
• Más frecuente: t(8;14)
• ‘Breakpoints’: alta variabilidad (PCR)
• FISH split: lo más útil

58. MORFOLOGÍA Y PATRÓN INMUNOHISTOQUÍMICO EN EL LINFOMA DE BURKITT
CD20
HE
CD10 BCL6
EBER MIB1

59. FISH – Reordenamiento en MYC
• También útil:
– Como marcador de progresión (Aberración
secundaria)
– Para la detección de LBCG con doble
translocación (“double hit”): BCL2 + MYC

60. FISH
BCL-2 MYC

61. Linfoma B Difuso de Células Grandes con
reordenamiento de BCL-2 y MYC
(Linfoma de la zona gris)

62. Translocación en ALK
• Usualmente los linfomas anaplásicos portan
ALK split probe
la t(2;5) – ALK/NPM
• Posibilidad de diversos patrones
ALK1
“INMUNOFISH”

63. Técnicas moleculares en el
diagnóstico de linfomas no Hodgkin
• Estudios de clonalidad: PCR
• Translocaciones características: FISH
• Material de rutina (Fijado en formol e
incluido en parafina)
• Técnicas útiles, pero deben ser interpretadas
en el contexto clínicopatológico

64. Dave SS et al. Molecular diagnosis in Burkitt’s lymphoma.
N Engl J Med (2006) 354: 2431-2442

66. DIAGNÓSTICO
• Datos Clínicos
• Estudio Morfológico
• Estudio Inmunohistoquímico
• Estudio Molecular

68. Plasmocitoma (HE)

69. Linfoma de Burkitt

70. Gracias por vuestra atención
Facultad de Medicina (Universidad de Santiago