Técnicas para la determinación “in situ” de proteínas en un tejido (o frotis) Reacción Ag-Ac Detección por una señal de color visible al MO

1. Dr. Carlos Barrionuevo Cornejo
Profesor Asociado Facultad de Medicina
UNMSM
Jefe del Servicio de Patología Quirúrgica
Departamento de Patología
INEN

2. DEFINICION
 Técnicas para la determinación “in situ”
de proteínas en un tejido (o frotis)
 Reacción Ag-Ac
 Detección por una señal de color visible
al MO

5. Anticuerpos monoclonales yAnticuerpos monoclonales y
policlonalespoliclonales

6. Anticuerpos
 Filamentos intracelulares
 Epitelio, mesénquima, musculares, gliales, etc.
 Marcadores celulares
 Melanocitos, células germinales, endocrinos, neurogénicos, células
basales, mama, etc.
 Hematopatología
 CDs
 Agentes infecciosos
 Virus, bacterias, parásitos
 Hormonas
 Factores pronóstico y predictivos
 Genes reparadores

7. Procesamiento de IHQ
 Fijación tisular
 Procesamiento tisular
 Recuperación antigénica
 Sistemas de detección de IHQ

8. FIJACION TISULAR
 Formol neutro, pH7 (1 litro):
Sodio fosfato monobásico monohidrato 3.5
gr
Sodio fosfato dibásico anhidro 6.5 gr
H20 destilada 900 cc
Formladehido solución al 37% 100cc

9. FIJACION TISULAR
 Volumen: x 10
 Muestras hasta 0.5 cm: 6 a 24 h
 Muestras de mayor tamaño: 24 a 48 h

10. Procesamiento tisular
 4 etanoles de 960
 3 etanoles de 990
 Alcoho-xilol
 2 xiloles
 2 parafinas líquidas

11. Recuperación antigénica
 Formol y parafina alteran estructura
proteica
 El pre-tratamiento con calor o enzimas
recupera o “desenmascara” los Ag
(epítopes)
Rompe enlaces cruzados
Eliminación de iones de calcio con citrato

12. Recuperación antigénica
 Buffer
Buffer citrato 0.01 mol/L, pH 6
Buffer Tris/EDTA, pH 9
 Métodos
Digestión enzimática
Horno de microondas
Calentamiento al vapor

13. SISTEMAS DE DETECCION EN
INMUNOHISTOQUMICA
 Un solo paso o directa (IF)
 Indirecto de dos pasos
 Peroxidasa-antiperoxidasa (PAP)
 Fosfatasa alcalina-antifosfatasa alcalina (APAAP)
 Complejo Avidina-Biotina (ABC)
 Avidina-Biotina Marcada (LAB)
 Estreptavidina-Biotina Marcada (LSAB)
 Amplificación de señal catalizada (CSA)
 Polímeros

15. Método directo e indirecto

16. Método PAP y APAPMétodo PAP y APAP

17. Método ABCMétodo ABC

18. Método de LSAB o LABMétodo de LSAB o LAB

19. Método de CSA 1: pasos 1,2,3

20. Método de CSA 1: pasos 4 y 5

21. CD23 CD2

22. Método de polímerosMétodo de polímeros

23. Método de polímerosMétodo de polímeros

24. Sensibilidad (de menor a mayor)
 PAP
 ABC
 LAB (4 a 8 veces más que ABC)
 LSAB y ABC modificado (CSA)
 Polímeros

25. Coloración simultanea

26. CD20 y CD3

27. Quer, CD68 y CD20

28. PATRONES DE TINCIÓN
 MEMBRANA
 GRANULAR
 CITOPLASMATICO
 NUCLEAR (NUCLEOLAR)
 PARANUCLEAR (GOLGI)
 EXTRANUCLEAR

29. CD20

30. Sinaptofisina

31. Citoquaratina

32. TdT

33. CD30

34. Rol de la IHQ
 Determinación de estirpe celular (tumores
malignos indiferenciados, tumores
metastásicos de origen desconocido)
 Benigno vs maligno
 Clasificación de diversas neoplasias
 Determinación de antígenos pronósticos y
predictivos
 Blancos terapéuticos
 Determinación de agentes infecciosos

36. Evaluación Patológica
 Datos clínicos
Edad
Ubicación y extensión
○ Ganglio linfático
○ Órgano
 Morfología
 Inmunhistoquímica: marcadores
selectivos

40. “Marcadores específicos”
 PSA: próstata
 TTF1: pulmón, tiroides
 Tiroglobulina: tiroides
 Hep-PAR1 (OCH1E5): hígado
 CD45 y otros CD: hematolinfoide

41. Algoritmos en IHQ
 Pocos marcadores “específicos”
 La mayoría se encuentran en varios tumores
diferentes aunque con diferente distribución
 Combinados: tablas de probabilidades
 Algoritmos diagnósticos

42. Algoritmos en IHQ
 Muchos
 Secuencia razonable
 Disponibilidad de Ac
 No siempre resuelven un problema
 ¡MORFOLOGIA Y CLINICA!

43. Patrones morfológicos
 Neoplasia epitelioide
 Neoplasia de células redondas
 Neoplasia sarcomatoide
 Neoplasia de patrón mixto (epitelioide-
sarcomatoide)
 Etc., etc.

45. Neoplasia epitelioide
Ker+
CK7 CK20

46. Neoplasia epitelioide
Queratina+
CK7+CK7+ CK7-CK7-
CK20+CK20+ EstómagoEstómago
PancreasPancreas
Vías biliaresVías biliares
Vías urinariasVías urinarias
Adenoca mucinoso ovarioAdenoca mucinoso ovario
ColonColon
RectoRecto
CK20-CK20- PulmónPulmón
TiroidesTiroides
Glándulas salivalesGlándulas salivales
MamaMama
EndometrioEndometrio
Ovaro (no mucinoso)Ovaro (no mucinoso)
MesoteliomaMesotelioma
HígadoHígado
RiñónRiñón
PróstataPróstata
Carcinoma escamosoCarcinoma escamoso

47. Neoplasia epitelioide queratina+ en
adolescentes o adultos jóvenes
 CD30: carcinoma embrionario
 AFP : tumor del saco vitelino, carcinoma
embrionario
 HCG : coriocarcinoma

48. Neoplasia epitelioide
Ker -
S100 CD30 Vim

49. Neoplasia epitelioide
Ker-/pS100+
HMB45+ Melan A+ Vim+
Melanoma TVNPM

50. Neoplasia epitelioide
Ker-/CD30+
CD45-/+ ALK1+/- AFP-/+
LACG Ca embr

51. Neoplasia epitelioide
Ker-/Vim+
CD45- CD30- MelanA- HMB45-
Sarcoma

53. Neoplasia de células redondas
CD45
+ -
LNH Ker
+ -
Carcinoma pS100 -
Sinoviosarc Desmina
T desmoide + + -
Melanoma Rabdomiosar CD99
PNET T desmoide +
Sinoviosarc
T desmoide PNET

54. Neoplasia de células redondas
CD45+
CD20+ CD3+ CD30+
LNH B LNH T LACG

57. Neoplasia sarcomatoide
Ker/EMA
+ - pS100
Carcinoma
Sinoviosarc + -
S epiteliode CD34
Schwanomma
Neurofibroma + -
Melanoma Actina
TVNPM +
S Kaposi T muscular
T fibroso sol HFM

58. Neoplasia sarcomatoide
Ker-/pS100-/Vim+
Pan Actina+
Alfa actina Mio D1 Desmina
Leiomiosarcoma Rabdomiosarcoma

64. Clasificación molecular del
carcinoma mamario
 Clasificación
Luminal A
Luminal B
Tipo basal
Tipo CerbB2
 Anticuerpos
Receptores de estrógenos
CerbB2
CK5/6

65. Clasificación molecular del carcinoma
mamario con IHQ
Luminal ALuminal A Luminal BLuminal B Tipo basalTipo basal CerbB2CerbB2
R/EstrógenoR/Estrógeno
ss
PositivoPositivo PositivoPositivo NegativoNegativo NegativoNegativo
CerbB2CerbB2 NegativoNegativo NegativoNegativo NegativoNegativo PositivoPositivo
CK5/6CK5/6 NegativoNegativo NegativoNegativo PositivoPositivo NegativoNegativo

66. Clasificación molecular del
LCGBD
 Clasificación:
Tipo células B centrogerminales (GCB)
Tipo células B activadas (ABC)
 Anticuerpos
GCET1, CD10, MUM1, BCL6, FOXP1

67. Clin Cancer Res 2009;15(17) September 1,
200

69. Proteínas pronósticas
 Carcinoma mamario
Receptores hormonales
CerbB2 (Her2/neu)
P53
Ki67
Ciclina D1
BCL2
EGFR

71. Proteínas pronosticas
 Carcinoma colónico
Proteínas reparadoras (MLH1, MSH2, MSH6)
P53
EFGR
Timidilato sintetasa
Ki67

75. Proteínas pronosticas
 Carcinoma prostático
P27
Ki67
 Carcinoma pulmonar
EGFR
Ki67
 Carcinoma urotelial
P53
Ki67
Rb

80. En uso actual
 CARCINOMA MAMARIO
 Receptores hormonales: TAMOXIFEN
 Herceptest: TRASTUZUMAB
 LINFOMA DE CÉLULAS GRANDES B DIFUSO
 CD20: RITUXIMAB
 TUMOR DEL ESTROMA GASTROINTESTINAL
 CD117 (c-Kit): IMATINIB

82. Otros
 CARCINOMA DE ESTÓMAGO
 Herceptest
 CARCINOMA PULMONAR
 EGFR (amplificación)
 CARCINOMA DE COLON
 EGFR

84. Arrays de tejidos (TMA)

85. Arrays de tejidos (TMA)

86. Arrays de tejidos (TMA)

87. Arrays de tejidos (TMA)

89.  HERRAMIENTA AUXILIAR QUE
UTILIZA EL PATOLOGO PARA
Diagnóstico
Pronóstico
Tratamiento

90.  MORFOLOGIA
 CLINICA
 ¡¡UNA FIJACION ADECUADA Y UN
BUEN PROCESAMIENTO TECNICO!!

91. GRACIAS !!!