Investigación de la Universidad de Zaragoza (Spain) con chaperonas para mejorar el funcionamiento de la enzima PAH de la PKU

1. UE/EU-FEDER/ERDF
Investigación en chaperonas para PKU
Javier Sancho
Dep. Bioquímica y Biología Molecular y Celular. Universidad de Zaragoza
Inst. de Biocomputación y Física de Sistemas Complejos (BIFI). Universidad de Zaragoza
Instituto Aragonés de Ciencias de la Salud. Universidad de Zaragoza
VI Congreso Regional de Enfermedades Metabólicas Hereditarias de la Región de Murcia 18-20 septiembre 2015. La Manga (Murcia)

2. Mutaciones desestabilizantes en la
enzima FAH
908 mutaciones conocidas
(a 5 de septiembre de 2015)
1:10000 recien nacidos
Introducción
4 SUBUNIDADES

3. Proteína
antes de plegarse
(NO FUNCIONA)
Introducción

4. Proteína
Bien plegada
(SI FUNCIONA)
Introducción

5. Proteína
Bien plegada
(SI FUNCIONA)mutaciones PKU
Introducción

6. Proteína
Bien plegada
(SI FUNCIONA)
= Chaperona farmacológica
Kuvan
Tafamidi
s
Fenilcetonuria
Amiloidosis TTR
Introducción

7. Temperatura
% Proteína
inactiva
Tm
100
50
0
Introducción
Las proteínas emiten luz que cambia de color cuando se inactivan por el calor
T´m

8. Omeprazol
Aspirina
Ibuprofeno
N+
N
I-
N
O
OHO
N
N
S
O
Cl
N
N+
-
O
OO
NH2
O
O
N+
N
N
O
S
-
O
O
O
O
N
N
O
HO
S
N O
O
O
Cl
Cl
N
N
H
O
O
Cl
N
N S
S
N
H
102 millones de compuestos químicos
(4 sep 2015)
Usamos QUIMIOTECAS:
selecciones
representativas
Kuvan
Introducción

9. Aceite mineral
Fenilalanina hidroxilasa+
1 compuesto (o varios)
30 40 50 60 70
0
1
2
3
4
Fluorescencia
Temperatura (º C)
B7 D4 E11 G8 H11
40
44
48
52
Tm
Compuestos candidatos
Tm
35 40 45 50 55 60
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
Señalnormalizada
Temperatura (º C)
Cribado rápido mediante ensayos de estabilidad
Trabajo previo Búsqueda inicial de nuevas chaperonas

10. Temperatura (oC)
30 40 50 60 70
Fraccióndesplegada
0.0
0.5
1.0
N
N
H
N
O
N
NH2
I
N
N+
N N
N
O-
O
II
N
N
NH2
O
NO2
III
N
N
H
S S
N
O
IV
Descubrimiento de 4 compuestos
que estabilizan la FAH silvestre
greenred
cyan blue
PAH
alone
Pey et al. 2008.
Identification of pharmacological chaperones as potential therapeutic agents to treat phenylketonuria.
Journal of clinical investigation 118: 2858-2867.
Prof. A. Martínez
(U Bergen)
Trabajo previo Búsqueda inicial de nuevas chaperonas

11. III IV
Aumenta la cantidad de proteína
III IV
Aumenta la actividad enzimática
Efecto de los compuestos III y IV
en células que expresan FAH
silvestre o con mutaciones PKU
PAHactivity(nmol/min.mg)
0
1
2
3
DMSO III IV
*
*
A
PAHproteinfold
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
DMSO III IV
B
* *
DMSO III IV
Efecto de los compuestos III y IV tras
administración oral a ratones sanos
Trabajo previo Búsqueda inicial de nuevas chaperonas

12. Estructura de la unión entre la FAH y la chaperona IV
Torreblanca et al. 2012
Structural and mechanistic basis of the interaction between a pharmacological chaperone and human phenylalanine hydroxylase
ChemBioChem 13:1266-1269
Dr. Ramón Hurtado
Univ. Zaragoza
Trabajo previo Búsqueda inicial de nuevas chaperonas

13. Objetivos:
Identificar y desarrollar nuevas chaperonas útiles para fenilcetonuria
Comparar su espectro de acción y su eficacia con los de Kuvan
Fenilcetonuria
Diagnóstico y combate molecular de tres
enfermedades neurodegenerativas:
Parkinson, fenilcetonuria y amiloidosis TTR

14. Fenilcetonuria
Acciones
Diseño computacional de mejores chaperonas basadas en la chaperona IV
Juan José Galano Frutos (Zaragoza)
Dr. Rui Brito (Coimbra)
Síntesis química y ensayo in vitro de las nuevas chaperonas diseñadas
María Galiana (Zaragoza)
Míriam Alías (Zaragoza)
MD Díaz de Villegas (Zaragoza)
María Conde (Zaragoza)
Cribado experimental de nuevas quimiotecas de mayor tamaño
para descubrir nuevas chaperonas
Sandra Salillas (Zaragoza)
Ensayos de toxicidad y eficacia en
células humanas y en ratones sanos.
Comparación con Kuvan
María Conde
Dra. Marie-Lise Maddelein
Mejora racional de uno de los compuestos
previamente encontrados (compuesto CIV)
N
N
H
S S
N
O
IV
Búsqueda de nuevas chaperonas
ensayando quimiotecas mayores

15. Cálculos “alquímicos” de energía de unión (AFEC)
ΔGbind(B)
ΔGbind(A)
ΔGA-B
bound
ΔGA-B
unbound
ΔGbind(A) + ΔGA-B
bound
- ΔGbind(B) - ΔGA-B
unbound
= 0
ΔΔGB-A = ΔGA-B
bound
- ΔGA-B
unbound
Juan José Galano
Diseño computacional de mejores chaperonas basadas en la chaperona IV

16. Síntesis química y ensayo in vitro de las nuevas chaperonas diseñadas
María Galiana Dra. Míriam Alías
Dra. MD Díaz
de Villegas
Cribado de una
quimioteca
Estab. Térmica de FAH
Estruct. cristalina
enzima + chaperona
Estudio de la coordinación
de chaperona y enzima
Modificación de
sustituyentes
IV
María Conde

17. -4
-3
-2
-1
0
1
-8 -6 -4 -2 0 2
y = -0,18+ 0,52x R= 0,902
aumentodeenergíadeuniónMEDIDO
(kJ/mol)
aumento de energía de unión CALCULADO
(kJ/mol)

18. Nuevas posibles chaperonas más potentes
20 30 40 50 60 70 80
-0,2
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
Unfoldedfraction
Temperature (C)‫؛‬
VP1
VP2
VP3
VP4
VP5
VP6
VP7
VP8
VP9
VP10
VP11
VP12
VP13
Control
Sandra Salillas
Cribado experimental de nuevas quimiotecas de mayor tamaño para descubrir nuevas
potenciales chaperonas

19. Comparación con Kuvan
20 30 40 50 60 70 80
-0,2
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
Unfoldedfraction
Temperature (ºC)
Control
VP13
Kuvan
Sandra Salillas
Cribado experimental de nuevas quimiotecas de mayor tamaño para descubrir nuevas
potenciales chaperonas

20. Compuestos que
estabilizan a la
enzima activa
¿tienen efecto estos compuestos en la estabilidad y
plegamiento de distintos mutantes de la proteína?
I65T
PKU
moderada
Y414C
PKU leve
R241H
PKU leve
V245L
PKU clásica
E280K
PKU clásica
V388M
PKU moderada
A395P
PKU clásica
R408Q
PKU leve
mutaciones que responden a Kuvan
mutaciones que no responden a Kuvan
María Conde
Ensayos de toxicidad y eficacia en células transfectadas y en ratones sanos.
Comparación con Kuvan
Dra M-L Maddelein
(Francia)

21. Compuestos que
estabilizan a la
enzima activa
¿tienen efecto estos compuestos en la estabilidad y
plegamiento de distintos mutantes de la proteína?
¿son compuestos tóxicos en células humanas?
¿tienen efecto estos compuestos en células
humanas?
¿tienen efecto estos compuestos en modelos
animales de la enfermedad?
Ensayos de toxicidad y eficacia en células transfectadas y en ratones sanos.
Comparación con Kuvan
María Conde
Dra M-L Maddelein
(Francia)

22. Ensayos de toxicidad y eficacia en células transfectadas y en ratones sanos.
Comparación con Kuvan
María Conde
Dra M-L Maddelein
(Francia)

23. Mutaciones a
Mutaciones b
Mutaciones c
~ 900 mutaciones
conocidas en la
proteína FAH
Dietas bajas en Phe/ tratamiento con Kuvan
Chaperonas
farmacológicas
Otras terapias
Cribado de
alto
rendimiento
Validación in vitro de los
compuestos
prometedores
Ensayos de toxicidad y
efectividad in vivo con
células humanas
Ensayos in vivo con
modelos de la
enfermedad
Potencial
chaperona
farmacológica
Perspectiva

24. Otras enfermedades metabólicas
MSUD como ejemplo

25. El complejo de la deshidrogenasa de alfacetoácidos de cadena ramificada (BCKD)

26. El complejo de la deshidrogenasa de alfacetoácidos de cadena ramificada (BCKD)
Es una enzima compleja formada con participación de 4 genes ( , , , )

27. El complejo de la deshidrogenasa de alfacetoácidos de cadena ramificada (BCKD)
Es una enzima compleja formada con participación de 4 genes ( , , , )
E1
descarboxilasa
E2
transacilasa
E3
deshidrogenasa
E2 /12 E1 /6 E3
EN TOTAL 84 SUBUNIDADES
Distintas mutaciones en cualquiera de esos cuatro
genes reducen o eliminan la función de la enzima y
hacen que se acumulen sustancias tóxicas que
causan la enfermedad del jarabe de arce

28. GEN proteína Variantes
en OMIM
Descritas
como
patológicas
Potencialmente
Recuperables con
chaperonas
%
Enfermedad del jarabe de arce
BCKDHA Sub. α de la
descarboxilasa (E1)
76 31 16 50 %
BCKDHB Sub. β de la
descarboxilasa (E1)
81 35 17 50 %
DBT Sub. de la transacilasa
(E2)
67 27 7 25 %
DLD Sub. de la
deshidrogenasa (E3)
47 12 10 90 %
271 105 50 48 %
Fenilcetonuria
PAH Subunidad única 615 120 72 60 %

29. Enfermedad Enzima
defectuosa
Ubicación
PKU Más
sencilla
citoplasma
Jarabe de
arce
Más
compleja
mitocondria
s

30. Enfermedad Enzima
defectuosa
Ubicación Terapia de
reemp.
enzimático
PKU Más
sencilla
citoplasma Más fácil
Jarabe de
arce
Más
compleja
mitocondria
s
Difícil

31. Enfermedad Enzima
defectuosa
Ubicación Terapia de
reemp.
enzimático
Chaperonas farmacológicas
Hay
cofactores?
PKU Más
sencilla
citoplasma Más fácil Sí: BH4
(Kuvan)
Jarabe de
arce
Más
compleja
mitocondria
s
Difícil Sí:
E1: TPP
E2: Acido
Lipoico, Co A
E3: FAD, NAD

32. Enfermedad Enzima
defectuosa
Ubicación Terapia de
reemp.
enzimático
Chaperonas farmacológicas
Hay
cofactores?
Son posibles
otras
chaperonas?
PKU Más
sencilla
citoplasma Más fácil Sí: BH4
(Kuvan)
Sí
Jarabe de
arce
Más
compleja
mitocondria
s
Difícil Sí:
E1: TPP
E2: Acido
Lipoico, Co A
E3: FAD, NAD
Sí

33. Enfermedad Enzima
defectuosa
Ubicación Terapia de
reemp.
enzimático
Chaperonas farmacológicas
Hay
cofactores?
Son posibles
otras
chaperonas?
Harán
falta
varias?
PKU Más
sencilla
citoplasma Más fácil Sí: BH4
(Kuvan)
Sí Menos
probable
Jarabe de
arce
Más
compleja
mitocondria
s
Difícil Sí:
E1: TPP
E2: Acido
Lipoico, Co A
E3: FAD, NAD
Sí Mas
probable

34. Tenemos
preguntas