PCR para enterobacterias

1. PRUEBAS MOLECULARES EN APOYO
A DIAGNÓSTICO DE
Vibrio cholerae, Vibrio parahaemolyticus,
Salmonella spp, E. coli.
QFB. OSCAR URIEL ALVAREZ NERI
Lab. Microbiología Epidemiológica
Febrero 2016

2. V. cholerae
V. parahaemolyticusPUNTO FINAL
E. coli
PCR Bacillus anthracis
Bordetella
RicketsiasTIEMPO REAL
Leptospiras

3. Salmonella
E. coli
V. cholerae
PFGE
V. parahaemolyticus
Enterobacter
Klebsiella
Neisserias

4. PCR
La reacción en cadena de la polimerasa, (polymerase
chain reaction), es una técnica de biología molecular
desarrollada en 1986 por Kary Mullis, cuyo objetivo es
obtener un gran número de copias de un fragmento de ADN
particular

5. Componentes de la reacción
* Cuatro desoxirribonucleótidos-trifosfato (dNTP)
* Dos iniciadores (en inglés primers)
* ADN polimerasa, la más común es la polimerasa Taq
* ADN molde, que contiene la región de ADN que se va a amplificar.

6. Etapas de la PCR:
* Desnaturalización
* Alineamiento
* Alargamiento (polimerización)

10. Detección del producto de la PCR
* Electroforésis
**agarosa
**poliacrilamida
La posterior visualización se puede realizar con
bromuro de etidio, gel star (lámpara de luz UV),
tinción de plata.

12. Concentración recomendada de gel de agarosa para
separar moléculas de ADN lineales.
Porcentaje Gramos de agarosa Gramos de agarosa Fragmentos de
del gel (30mL de TBE 1X) (100mL de TBE 1X) ADN
(%) (7 X 10 cm) (15 X 10 cm) (pb)
1
2
2.5
0.300 1,00 500 – 10 000
0.600 2,00 100 – 2 500
0.750 2,50 50 – 1 000

14. 2 µL de Buffer de
Carga (naranja G)
PARAFILM
8 µL de muestra

18. Muestra
Laboratorio de
Recepción de muestras
Laboratorio de
Cólera-Enterobacterias
Identifica bioquímicamente
V. cholerae, Escherichia coli o V. parahaemolyticus
Envía cepa a Laboratorio
de Bacteriología Molecular
Realiza
PCR punto final
Resultado se entrega a
Lab. de Cólera-Enterobacterias

19. CEPA
Vibrio cholerae, Escherichia coli o
Vibrio parahaemolyticus
Resuspender 1- 3 colonias en
200 µL de agua destilada
Hervir 15 min

23. GENES DE E. coli
gen Pares de bases (pb) Codifica para
LT 322 Toxina Termolábil
ST 185 Toxina Termoestable
ial 320 Locus asociado a la invasividad
bfp 324 Subunidad A del pili BFP
Hly A 1551 Hemolisina
eae 384 Fracción de A/E
stx1 150 Toxina similar a Shiga (stx1)
stx2 255 Toxina similar a Shiga (stx2)
aat 630 Factor de adherencia

24. 484 T+ 484 T+ 484 T+Bco T- 482 483 Bco T- 482 483 Bco T- 482 483
aat
bfp
LT
ial
ST
484 T+Bco T- 482 483 T+Bco T- 482 483 484
Hly A
eae
stx2
stx1

26. Escherichia coli
7
enterohermorrágica
81 2 3 4 5 6
hlyA
eaeA
Stx2
Stx1
Banda hlyAde 1551 bp,
Banda eaeAde 384 bp,
Banda Stx1 de 255 bp,
Banda Stx2 de 150 bp.
CARRIL MUESTRA
1 ΦX 174/Hae III
2 BLANCO
3 Escherichia hermanii
4 Escherichia coli ATCC 25922
5 Cepa H. Gea González Agar Sangre
6 Cepa H. Gea González Base de Agar
Sangre
7 Testigo Positivo
Escherichia coli O157 H7
8 ΦX 174/Hae III

27. EPIDEMIOLOGÍA MOLECULAR
Utiliza técnicas de biología molecular con el fin de
evidenciar relaciones entre aislamientos de una misma
especie, como herramienta para la vigilancia e
investigación de brotes.

29. PFGE (pulsed field gel electrophoresis)
Schwartz y Cantor desarrollaron en 1984 un
sistema denominado electroforesis en gel de
campo pulsante (PFGE) con el que consiguieron
separar cromosomas de levadura de varios
cientos de kpb
Es una técnica usada para la separación de
moléculas de DNA muy largas en un gel de
agarosa por la aplicación cambios periódicos
dirección de un campo eléctrico.
de

30. PFGE
a 610 nm
Buffer
1mm +Buffer
* 4 veces con TE 1X
con BrEt
RevelarAnalizar
Bionumerics
Preparar gel 1%
incluyendo el
plug
Realizar
corrimiento
18-22h
Cortar Plug
Lavar
* 2 veces con H2O
Restricción
37°c o 50°C
2 a 4 h
Eliminar
Verter en
Moldes
(PLUG)
Plug
+BLC
+Prot K
Incubar a 54°C
1.5-2h con
Agitación
Ajustar DO 0.8-1Suspender en
BSC
Cepa pura
18-24h
Suspensión
+agarosa 1%
+ Prot. K

37. Somos miembros de la Red de PulseNet América Latina
y el Caribe desde el año de 2004.
Existe interacción entre Latinoamérica cuando existen
brotes de interés internacional.

38. Certificado para realizar geles de Salmonella spp., y
Vibrio cholerae.
Certificado para realizar análisis de Salmonella spp.,
y Vibrio cholerae.

39. Instituto de Diagnóstico y Referencia Epidemiológicos.
México Departamento de Bacteriología
Laboratorio de Bacteriología Molecular.
Comparación de huellas enviadas, de corrimientos de cepas de Salmonella Agona asociadas a un
brote del 2011 en USA de alimento (papaya), enviadas por el CDC para detección de casos en
nuestro país.
No se encuentran huella similares en las cepas de nuestro país.

40. 04 Cepas aisladas de Salmonella Braenderup obtenidas de coprocultivo del
estado de Sinaloa, comparadas contra la cepa asociada a un brote por
mangos en Canadá, aislada de humano.
31agosto2012

41. Corrimiento de 21 cepas de 24 de Salmonella Enteritidis del estado de
Michoacán observándose un 100% de similitud en 15 de ellas. 04sept14
Herramienta “Show bands”

42. 11 cepas de Salmonella Schwarzengrund digeridas con la primer enzima XbaI , brote Michoacán
25-mayo-2012

43. 11 cepas de Salmonella Schwarzengrund digeridas con la segunda enzima BlnI , brote Michoacán
Evidencia de bandas por sistema Bionumerics, 3 cepas (1482,1483 y 1486) pierden la novena banda,
sin embargo se observa un 95.2% de similitud con las demás, y recordando que con la primer enzima
obtenemos un 100%, podemos concluir que se trata de la misma clona.
05-junio-2012

44. Corrimiento de 9 cepas de Salmonella ser. Oranienburg y comparadas contra la
cepa reportada en un brote en USA aislada de semillas de Chia. No tenemos
aislamientos reportados en nuestro país de estas semillas. Concluimos que las
cepas circulantes en nuestro país son diferentes a las reportadas.01julio2014

46. CASO E.coli EN HOSPITAL INFANTIL

47. Enterobacter cloacae en jardín de niños

48. Klebsiella pneumoniae y Enterobacter cloacae