Primer seminario de la tercera clase.

1. Patricia Bedecarrás
Centro de Investigaciones Endocrinológicas (CEDIE)
División de Endocrinología, Hospital de Niños "R. Gutiérrez“
pbedecarras@cedie.org.ar
HORMONA
ANTI-MÜLLERIANA

2. 2. AMH en el HOMBRE:
 Regulación de la AMH en el testículo
 Utilidad Clínica
1. Introducción
3. AMH en la MUJER:
 Regulación de la AMH en el ovario
 Utilidad clínica
AMH: HORMONA ANTI-MÜLLERIANA

3. AMH : HORMONA ANTI-MÜLLERIANA
¿ Qué es la AMH ?
1. Introducción

4. CROMOSOMA
El gen
La proteína
412 143 109 160 856
2.8 kbp
Codifica el fragmento
bioactivo
0.5 kbp
RAQRSAGAT
RAQRSAGAT
CGCR
CGCR
LRAEE
LRAEE
140 kDa full-length AMH
Agentes protelíticos
LRAEE
LRAEE
RAQR
RAQR
SAGAT
SAGAT
CGCR
CGCR
110 kDa N-terminal 25 kDa C- terminal
RAQRSAGAT CGCRLRAEE
70 kDa AMH monomer
Dimerización
Josso et al. Trends in Ennndocrinol Metab. 2003
19p 13.3
Pro-AMH
AMHN AMHC
Pre-Pro-AMH
AMHNC

5. Gly/Ser
Tipo I
COOH
Dominio
Intracelular
Dominio de
Transmembrana
Dominio
Extracelular
Caja de Cisteínas
Cisteína
Dominio Kinasa
Sitio de N-glicosil.
Tipo II
(específico)
COOH
Cromosoma 12
p
q
13.2
ALK2
ALK3
ALK6
Activin receptor-like kinasa
Receptores de AMH

6. DHT
Testosterona
célula de
Leydig
Receptor
Andrógenos
Epidídimo
Cond. deferente
Vesícula
seminal
Seno urogenital y
Genitales externos
AMH Receptor
AMH
Utero
célula de
Sertoli
Control hormonal de la diferenciación sexual
Trompas de Falopio
Utero
1/3 sup. vagina

7. Testículo
fetal
C. de Sertoli
AMH
-
C. Leydig
Testosterona
+
Xavier et al. Mol cell endocrinol. 2003
Período de sensibilidad a la AMH
8va a 10ma semana de gestación

8. - Autosómico Recesivo
Síndrome Persistencia de
Conductos de Müller
- Virilización externa Normal
- Criptorquidia – Hernia Inguinal
- Utero y Trompas de Falopio
- Varón 46 XY
Josso et al. Hum Reprod Update 2005

9. AMH : HORMONA ANTI-MÜLLERIANA
¿Cómo se mide AMH?

10. Hormona Anti-Mülleriana (AMH)
 1982: 1er. RIA
 1990: ELISAs desarrollados en Francia, USA y Australia
 1998: ELISA comercializado por Beckman Coulter Immunotech
(BC)
 2000: ELISA comercializado por Diagnostic System Laboratories
(DSL)
 2009: ELISA GEN II comercializado por Beckman-Coulter
 2015: 1er ensayo automatizado ELECSYS (ROCHE)

11. Estándar o Muestra
ELISA AMH
Lavado
2ºAc Biot-Strept
+ Peroxidasa
Lavado
Sustrato (TMB)
Solución Stop
Abs 450 nm
Tiempo total: aprox. 4 hs

12. SE MIDE EN: SUERO o PLASMA
LIQUIDO FOLICULAR
LIQUIDO SEMINAL
Se requieren 25 l de SUERO o PLASMA
~ 0,5 ml SANGRE
ELISA AMH
Beckman-Coulter-Immunotech
COEFICIENTE DE VARIACION INTRA-ENSAYO
36 pmol/l 5.3%
245 pmol/l 5.1%
COEFICIENTE DE VARIACION INTER-ENSAYO
31 pmol/l 8.7%
257 pmol/l 6.6%

13. VALIDACION DEL ENSAYO DE AMH
SENSIBILIDAD ANALITICA: 1 pmol/L (0.15 ng/ml)
ESPECIFICIDAD:
NO existe reactividad cruzada con: TGF-B, INHIBINA A, INHIBINA B, PROαC
SUBUNIDAD, ACTIVINA A
Para verificar:
LIMITE DE BLANCO: 2.24 pmol/l
LIMITE DE DETECCION: 2.53 pmol/l
AMH/MIS ELISA ® - Beckman

14. ECLIA (electroquimioluminiscencia) AMH
Ru
+
+
Ru
9 min 9 min
+
Micropartícula
de Streptavidina
Ru
MEDICIONAMH
Ac biotinilado anti-AMH
Ac anti-AMH
+ quelato de Rutenio LD = 0.07-164 pmol/l
Tiempo total: aprox. 18 min.

15. ELISA IOT vs ELISA DSL
Fréour et al. Clin Chim Acta (2007)
Streuli et al. Fertil Steril (2009)

16. AMH Gen II ELISA vs AMH Elecsys
ELISA GEN II vs ELECSYS

17. Grupo etáreo
AMH en 421 varones normales
AMH sérica: Valores de Referencia en Varones

18. AMH sérica: valores de referencia en mujeres
Edad (años)
0 10 20 30 40 50
AMH
pmol/l
0
20
40
60
80
100
120
97
3
50
n = 442
AMH ELISA Beckman-Coulter Immunotech ®
Hagen et al. JCEM (2010)
0
3
6
9
12
15
18
ng/mL

19. Valores Normales de AMH sérica: Varones vs. Mujeres
1200
800
400
0
(pmol/L)
1600
AMH/MIS ELISA
Immunotech-Beckman ®
165
110
55
0
(ng/mL)
220

20. AMH: HORMONA ANTI-MÜLLERIANA
AMH en el testículo
Generalidades y Funciones

21. Estructura del testículo
Tejido
intersticial
Cél. Leydig
Cél. Sertoli AMH
Inhibina B
Cél. germinales EspermatozoidesTubos
seminíferos
Testosterona

22. AMH : HORMONA ANTI-MÜLLERIANA
La AMH es un marcador específico
de las células de Sertoli

23. AMH/MIS ELISA
Immunotech-Beckman ®
AMH: HORMONA ANTIMÜLLERIANA
Varones
(pmol/L)
AMH sérica
600
400
200
0
800

24. AMH : HORMONA ANTI-MÜLLERIANA
A. Factores de transcripción
B. FSH
C. Andrógenos
Regulación de la secreción testicular

25. Regulación de la secreción testicular
A. Factores de transcripción
AMH : HORMONA ANTI-MÜLLERIANA

26. Activación transcripcional de la AMH
en el testículo fetal
Sox9 SF1 GATA4
WT1
AMH
CCCTTTGAGA CCAAGGTCA TGATAG
+ 1
Arango et al. 1999
Watanabe et al. 2000
Tremblay et al. 1999

27. Regulación de la secreción testicular
B. FSH
AMH : HORMONA ANTI-MÜLLERIANA

28. Regulación de la AMH por FSH: mecanismos responsables
Histología cuantitativa
FSH
Número
células de Sertoli
Células SMAT-1
5' AMH
Luciferasa
pGL-2
5' AMH
FSH
AMPc
Expresión
AMH
Producción
testicular total
de AMH
Lukas-Croisier et al., Mol Endocrinol, 2003
Ensayos de transfección
La FSH aumenta la producción de AMH

29. Regulación de la secreción testicular
C. Andrógenos
AMH : HORMONA ANTI-MÜLLERIANA

30. Los andrógenos inhiben la producción de AMH
Infancia Pubertad Adulto
NACIM.
Niveles
circulantes
Fetal
Testos-
terona
LH
FSH
AMH
Inhibina B

31. Testosterona (nmol/l)
0 3 6 9 12 15 18 21 24 27
0
20
40
60
80
100
AMH (ng/ml)
Pubertad
 Normal
 PP central
 Testotoxicosis
•Testotoxicosis (Mutación activadora R-LH
Edad (años)
5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
0
20
40
60
80
0
2
4
6
8
10
AMH (ng/ml) T (ng/ml)
Ketoconazol
100
Rey et al. JCEM. 1993
Los andrógenos inhiben la producción de AMH
Testosterona disminuye la expresión de AMH
independiente de la edad y de las gonadotrofinas

32. Testosterona intratesticular
Inhibe a la AMH
Feto Neon. Infancia Pubertad
AMH
Testosterona
Receptor Andrógenos en CSa partir del momento en que el
Receptor de Andrógenos
se expresa en los núcleos de
las células de Sertoli
Al-Attar et al. J Clin Invest. 1997
Chemes et al. JCEM 2008
Regulación de la AMH

33.  Testosterona intratesticular inhibe a la AMH, a
pesar de que la FSH está elevada.
 Ante la falta de acción inhibitoria de los andrógenos, la
FSH aumenta la secreción testicular de AMH
REGULACION DE LA AMH

34. AMH : HORMONA ANTI-MÜLLERIANA
Utilidad clínica de la determinación de
AMH en el VARON

35. Utilidad de la determinación de AMH
en PEDIATRIA

36. Testículos NO palpables:
Criptorquidia bilateral vs. Anorquia
AMH sérica
800
600
1000
400
200
0
AMH
(pmol/l)
Edad (años)
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
Anorquia
Criptorquidia bilateral
Josso, Horm Res. 1995

37. FUNCION GONADAL EN NIÑOS CRIPTORQUIDOS
AMH sérica
SDS
-4
-3
-2
-1
0
1
2
3
Criptorquidia bilateral Criptorquidia unilateral
AgonadismoHipo-
gonadismo
Normal
Bajo
N.D.
Función
normal
22 % 68 % 10 % 85 % 15 %
Hipo-
gonadismo
Función
Normal

38. Young et al, JCEM (2005)
AMH sérica (pmol/L)
0
250
500
750
1000
0 10 20 30
T (ng/dl)
39 ± 8
AMH en pacientes con
Hipogonadismo Hipogonadotrófico Congénito
Valores normales
Tanner I
Valores normales
Tanner V

39. Retardo constitucional
de la Pubertad
Hipogonadismo Hipogonadotrófico
Infancia Pubertad Adultez
NACIM.
Nivel
sérico
Fetal
T
LH
FSH
AMH
6 m. 14-18 a.
Inhibina B
Infancia
NACIM.
Nivel
sérico
Fetal
T
LH
FSH
6 m. 14-18 a.
AMH
Inhibina B
LH – FSH – T: bajas (prepuberales)
LH – FSH – T: bajas
Utilidad de la AMH en Retardo Puberal
AMH - Inhibina B: altas (prepuberales)
AMH - Inhibina B: bajas

40. Edad (años) Edad (años)
5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
0
20
40
60
80
100
0
2
4
6
8
10
AMH (ng/ml) T (ng/ml)
3 4 5
0
20
40
60
80
100
0
2
4
6
8
10
9 10 11 12
AMH (ng/ml) T (ng/ml
Ketoconazol Ketoconazol
Pubertad precoz independiente de gonadotrofinas:
Control del tratamiento

41. 500
1000
1500
2000
2500
AMH (pmol/l)
0
Disgenesia
Testicular
Defectos
Sínt. Andróg.
1. Disgenesia Testicular
2. Disfunción testicular
disociada :
a. células de Sertoli
b. células de Leydig
Rey et al. JCEM. 1999
AMH sérica
Anomalías de la diferenciación sexual

42. Determinación de AMH
en ADULTOS

43. SECRECION DIRECCIONAL DE AMH
AMH
AMH
AMH
Post-pubertadPre-pubertad
Cél. Sertoli
Espermato-
gonia
Cél. Sertoli
Espermato-
gonia
Espermato-
cito I
Rey et al. Mol Cell Endocrinol. 2003

44. AMH en líquido seminal
de hombres fértiles y pacientes azoospérmicos
AMH
(pmol/l)
0
100
200
300
400
500
600
Dador
fértil (n=18)
Azoospermia
no obstructiva (n=23)
Azoospermia
obstructiva (n=9)
AMH
(pmol/l)
0
10
20
30
40
50
60
Con espermatozoides (n=9)
Sin espermatozoides (n=14)
Azoospermia
no obstructiva
AMH seminal : marcador de espermatogénesis persistente,
con vistas a TESE
Fénichel et al. Hum Reprod. 1999

45. Isikoglu et al. Gynecol. Endocrinol. 2006
Niveles séricos de AMH en pacientes azoospérmicos
C
NOA con ez
NOA sin ez
C
NOA
Con ez
NOA
Sin ez
AMH sérica no predice la eficiencia de TESE en azoospermia
no obstructiva

46. En Pediatría
CONCLUSIONES I: AMH en el varón
 Existencia de tejido testicular (anorquia vs. criptorquidia bilateral)
 Evaluación de función testicular (tubular) en varón prepuberal
 Diagnóstico de ambigüedades genitales
 Pubertad precoz o retraso puberal
 Hipogonadismo hipogonadotrófico
En Adultos
 En líquido seminal: predictor de espermatozoides testiculares en
azoospermia no obstructiva.
 El testículo prepúber es un órgano activo.
 AMH sérica: marcador del número de células de Sertoli funcionales.
 Dosaje de AMH: NO test hCG

47. AMH : HORMONA ANTI-MÜLLERIANA
AMH en el ovario:
Generalidades y Funciones

48. FOLICULOGENESIS
Ovo-
gonia
Mitosis
Meiosis
Ovocito I
Atresia
Ovocito II
Folículo
Pre-ovulatorio
(de Graaf)
Selección inicial:
•Reclutamiento de los folículos en reposo
•Independiente de gonadotrofinas
•Desde la vida fetal hasta la adultez
~14 días
~10 meses
Folículo
Primordial
Ovocito I
Células Foliculares
Folículo
Primario
Ovocito I
Folículo
Preantral
(Secundario)
Ovocito I
Folículo
Antral
(Terciario)
Ovocito I
Teca
Selección cíclica:
•De los folículos en crecimiento
•Dependiente de gonadotrofinas
•En cada ciclo

49. AMH en el ovario
OVARIO
Cél. Granulosa
TESTICULO
Cél. Sertoli =
Expresión
AMH
Vigier et al, 1984
Rey et al, 2000
 Detección más temprana:
ovario fetal 23 semanas
Kuiri-Hänninen et al, 2011
Bézard et al, 1987
Ueno et al, 1989
Hirobe et al, 1994
Baarends et al, 1995
Rajpert-De Meyts et al, 1999
Rey et al, 2000
 AMH se expresa en: folículos
primarios, pre-antrales y antrales
pequeños.
 NO se expresa en: folículos
primordiales, atrésicos, teca y
cuerpo lúteo.

50. Visser & Themmen. Mol Cell Endocrinol (2005)
 AMH inhibe el reclutamiento de folículos primordiales
 AMH inhibe el desarrollo folicular estimulado por FSH
ACCION DE AMH EN EL OVARIO

51. AMH sérica en mujeres adultas
6
4
2
0
AMH
(ng/mL)
Folicular
temprana
Peri-
ovul.
Lútea
Cook et al, Fertil Steril (2000)
AMH durante
el ciclo menstrual

52. AMH : HORMONA ANTI-MÜLLERIANA
Utilidad clínica de la determinación de
AMH en la MUJER

53. AMH : HORMONA ANTI-MÜLLERIANA
AMH sérica como marcador
de reserva ovárica

54. 6
4
2
0
Serum AMH
(ng/mL)
< 25 25-30 30-35 > 35
Edad (años)
de Vet et al, 2002
AMH en la
edad reproductiva
AMH sérica en mujeres adultas
AMH marcador de reserva folicular
 AMH no detectable 5 años antes
del Ultimo Período Menstrual
Time prior to FMP (yr)
Sowers et al. 2008
Broer et al. 2010
La marca et al. 2012

55. AMH: marcador de reserva folicular
45
30
15
0
AMH sérica
(pmol/L)
0 10 20 30 40
Nº de folículos antrales (día 3)
Nº de folículos
antrales (día 3)
vs. r p
AMH 0.74 0.0001
Inh B 0.29 0.001
E2 -0.08 NS
LH 0.05 NS
FSH -0.29 0.001
r = 0.74
Fanchin et al., Hum Reprod (2003)

56. FALLA OVARICA PREMATURA
FACTORES EXOGENOS
• Infecciosas : Ooforitis urliana
• Iatrogénicas : Quimioterapia, radioterapia, talidomida
FACTORES ENDOGENOS
• Aberraciones cromosómicas: Sindrome de Turner
• Mutaciones génicas
MIXTAS
• Autoinmunes : Smes. Poliglandulares autoinmunes
• Enzimáticos : Galactosemia
Etiologías

57. AMH : HORMONA ANTI-MÜLLERIANA
AMH como marcador post-tto
oncológico

58. AMH: marcador de reserva folicular
Anderson et al. Hum Reprod 2006
AMH: marcador confiable de reserva ovárica luego de la quimioterapia
Efecto de la quimioterapia en mujeres
con cáncer de mama

59. Efecto de la Quimioterapia en la infancia
Bath et al. 2003
AMH
Volumen
del ovario
La quimioterapia durante la infancia afecta
la reserva ovárica en la vida adulta
Nx Chemo Nx Chemo
AMH: marcador de reserva folicular

60. Efecto de la quimioterapia
La afectación está en relación con el n°de ciclos
de quimioterapia recibidos.
Van Beek et al. JCEM (2007)
AMH: marcador de la reserva folicular
Mark et al JCEM (2012)

61. Efecto de la quimioterapia
AMH: marcador de la reserva folicular
Mark et al JCEM (2012)
AMH: marcador de recuperación de reserva folicular al
finalizar la quimioterapia.

62. AMH en Síndrome de Turner
Hagen et al. JCEM (2010)
 AMH: indetectable – muy baja
en 45,X  no hay folículos
Pubertad ausente
 AMH: normal – baja
en pocos 45,X
y otros Turners  folículos presentes
Pubertad espóntanea

63. AMH en Sindrome de Ovario Poliquístico (SOP)
9
6
3
0
AMH
(ng/mL)
Líq. Folic. Plasma
Fallat et al (1997)
La Marca (2004)
Normal
SOP
 SOP = AMH alta = menor n° de ovocitos maduros y menor tasa de fecundación

64. AMH sérica en SOP
0 5 10 15 20 25 30 35 40
0
20
40
60
80
100
120
AMH (pmol/L)
Nº folículos 2-5 mm
SOP
Controles
Pigny et al. (2003)
• AMH elevada
• Aumento del nº folículos 2-5 mm
• Correlación AMH – Folículos 2-5 mm
Cada folículo produce
cantidades normales de AMH

65. Evolución de la AMH sérica en pacientes con
tumores de células de la granulosa
Meses post-tto.
pmol/l
300
50
25
0
-0.1 3612 24 48 60
C
Cirugía
Cirugía
300
50
25
0
pmol/l
-0.4 4 5 70.3 1
D
Meses post-tto.
Cirugía
-15
A
Días post-tto.
pmol/l
300
403 101
50
25
0
Ooferectomía bilateral
pmol/l
-1 3 6 80.5
B
300
50
25
0
Meses post-tto.
Ooforectomía unilateral
AMH/MIS ELISA ®
Immunotech-BeckmanLong et al, JCEM 2000

66. CONCLUSIONES II: AMH en la mujer
 Marcador de folículos pequeños  reserva folicular
 Marcador de reserva folicular en FOP adquiridas (QMT)
 Niveles séricos estables durante el ciclo menstrual
 Caída progresiva  indetectable 5 años antes del último
período menstrual
 Elevada: marcador de SOP / alteración foliculogénesis
 Diagnóstico diferencial de tumores no epiteliales
 Seguimiento post-tratamiento de tumores de células de la
granulosa

67. MUCHAS GRACIAS

68. AP2
NFkB
P
P
AP2
P
NFkB
IkB
a
b
g AC
cAMP
PKA
AMH
FSH
Proliferac.
celular
Aumento de la secreción testicular de AMH
SAP62
Lukas-Croisier et al., Mol Endocrinol, 2003
Regulación de la AMH por FSH
Mecanismos moleculares
y celulares

69. Tanner III-V  afectación de las Células de Sertoli
LH (IU/L)
I II III-V
0
10
20
30
40
50
60
FSH (IU/L)
I II III-V
0
10
20
30
40
50
60
Testosterone (nmol/L)
I II III-V
0
5
10
15
20
AMH(pmol/L)
I II III-V
0
150
300
450
600
750
900
Inhibin B (ng/L)
I II III-V
0
100
200
300
400
500
600
Pro-aC (ng/L)
I II III-V
0
150
300
450
600
750
Bastida et al. Clin Endo (2007)
Hipogonadismo primario: Sme Klinefelter