1. UNIVERSIDAD DE ORIENTE
NUCLEO BOLIVAR
ESCUELA DE CIENCIAS DE LA SALUD
DEPARTAMENTO DE CIENCIAS FISIOLOGICAS
CATEDRA: BIOQUIMICA
PRATICA 2
“SALADO” (SALTING AOT) DE PROTEINAS, SU APLICACIÓN EN LA
SEPARACION Y DETERMINACION DE ALBÚMINA Y GLOBULINAS EN
SUERO O PLASMA SANGUINEO.
Docente: Elaborado por:
Dr. Miguel Basanta Manuel Serrano
Rene Devis
Ciudad Bolívar, Mayo del 2014.
2. Introducción.
Las proteínas son macromoléculas complejas desde los puntos de vista
físico y funcional, que desempeña múltiples funciones de importancia crucial.
Están sujetas a cambios físicos y funciones que reflejan el siglo de vida de los
organismos en los cuales residen.
Las proteínas son compuestos constituidos por aminoácidos unidos por
enlaces peptídicos. Son moléculas de elevado peso molecular. Según su
composición las proteínas se dividen en: Simples y Conjugadas, se producen por
hidrólisis de aminoácidos y otros componentes orgánicos e inorgánicos. Existen
millones de proteínas en nuestro cuerpo que efectúan funciones específicas, como
la de trasporte de gases catalíticos, de protección, etc.
Estas se pueden clasificar de acuerdo a su solubilidad en Albúminas,
Globulinas, Histonas, Protaminas y Escleroproteínas. En la presente práctica se
utilizan para estudio Albúmina y Globulinas, en cuanto a la Albúmina se puede
acotar que pueden precipitarse de sus soluciones con altas concentraciones de
sales proceso que se denomina salinización.
Para estudiar una proteína es necesario separarla utilizando diferentes
métodos que se basan en las diferentes solubilidades de las proteínas
ocasionadas por el PH (precipitación isoeléctrica), la polaridad (precipitación con
etanol o acetona) o la concentración salina (mediante la adición de sulfato de
amonio). (Harper, 2007)
Las sales neutras ejercen efectos pronunciados sobre la solubilidad de las
proteínas globulares. A baja concentración, las sales incrementan la solubilidad de
muchas proteínas, fenómeno que recibe el nombre de “salting in”. Por otra parte, a
medida que la fuerza iónica aumenta, la solubilidad de una proteína comienza a
disminuir y por lo tanto la proteína puede ser casi completamente precipitada de
su disolución, efecto llamado “salting out”.
Se considera importante describir a la albúmina, por ser ésta la
proteína a separar durante la actividad práctica por el método antes mencionado.
Es un tipo de proteína simple, compuesta de carbono, hidrógeno, oxígeno,
nitrógeno y un pequeño porcentaje de azufre. La albúmina es coagulable por el
calor, los ácidos minerales, el alcohol y el éter, y es soluble en agua y en
disoluciones diluidas de sal. Está presente en tejidos animales tales como la clara
de huevo, la leche y el músculo, además de encontrarse en el plasma sanguíneo.
3. Resultados
Se presenta una tabla de datos la cual contiene los resultados obtenidos
durante la precipitación de proteínas por medio del método de “Salting Out”,
realizado en la práctica del laboratorio para la cuantificación de las proteínas.
TABLA Nº 1.
Fuente: guía de laboratorio de bioquímica.
1º. Curva de calibración utilizando la lectura de los tubos 3 al 6 en
absorbancia contra mg de proteína contenidos en cada uno de los
mismos.
Para calcular los mg de proteínas en los tubos 3, 4, 5 y 6 se parte del
estándar de proteínas a concentración 8mg/ml, en el que se halla 8mg de
proteínas en 1ml de solución, así el cálculo se realiza mediante una simple regla
de tres utilizando los ml de solución para cada uno de los tubos, presentados en la
tabla anterior. El procedimiento se desarrolla a continuación:
Tubo Nº 3 estándar de proteínas = 0,25 ml
8 mg de proteínas 1 ml
X 0,25 ml
Tubos
1 2 3 4 5 6 7
Volumen en:
ml ml ml ml ml ml ml
Solución X1 proteínas totales
2
Solución X2 albumina
2
Estándar de proteínas 8mg/ml
0,25 0,5 0,75 1
NaCl 0,9%
1,75 1,5 1,25 1 2
Reactivo de biuret 4 4 4 4 4 4 4
mg de proteínas
2mg 4mg 6mg 8mg
4. X= 8mg proteínas x 0,25ml
1ml
Tubo n° 4: estándar de proteínas = 0,50 ml.
8 mg de proteínas 1 ml
X 0,50 ml
X= 8mg proteínas x 0,50ml
1ml
Tubo n° 5: estándar de proteínas = 0,75 ml.
8 mg de proteínas 1 ml
X 0,75 ml
X= 8mg proteínas x 0,75ml
1ml
Tubo n° 6: estándar de proteínas = 1 ml.
8 mg de proteínas 1 ml
X 1 ml
X= 8mg proteínas x 1ml
1ml
X = 8 mg de proteínas
X = 6 mg de proteínas
X = 4 mg de proteínas
X = 2 mg de proteínas
5. Conjuntamente con los resultados obtenidos en el laboratorio, expresados
en la tabla nº 2, y los calculados se procede a realizar la gráfica de la curva de
calibración.
TABLA Nº 2
Fuente: fotocolorímetro utilizado durante la practica en el laboratorio de bioquímica.
*Los valores de mg de proteínas de los tubos X1 y X2 se obtuvieron mediante
extrapolación de la Curva de Calibración.
GRÁFICO N°1: Curva de calibración.
Fuente: fotocolorímetro utilizado durante la practica en el laboratorio de bioquímica
Partiendo de estos resultados se procederá a comparar, por medio de la
relación entre la absorbancia y la concentración de proteínas totales, el valor de la
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
0 2 4 6 8 10 12 14
Absorvancia
Concentracion de Proteinas
Tubos Absorbancia Mg de proteínas
X1 0,769 11,75*
X2 0,380 5,80*
3 0,139 2
4 0,265 4
5 0,393 6
6 0,460 8
6. absorbancia de los tubos problemas y así de esta manera determinar la cantidad
de proteínas contenidas en la muestra lo que a su vez nos llevara a conocer la
cantidad total en un ml de suero humano, además de establecer una relación entre
la cantidad de albúmina y globulinas contenidas en la muestra de suero problema.
2º. Cantidad de proteínas totales en la solución X1 en base a la curva de
calibración.
Una vez realizada la extrapolación de los mg de proteína de X1, basándose en
la tabla nº 2, su absorbancia corresponde a 0,769 por lo que 11,75 corresponde a
los mg de proteína en dicho tubo de ensayo.
Primeramente para obtener la cantidad de proteínas totales en el tubo X1, es
necesario calcular dicha cantidad en la muestra inicial de 10 ml compuesta por
0.5ml de plasma o suero y 9,5 ml de NaSO4, de la cual solo se utilizó 2ml de esta
solución. Los cálculos son los siguientes:
2 ml de solución 11,75 mg de proteínas
10 ml de solución X
X = (10 ml de solución) x (11,75 mg de proteínas)
(2 ml de solución)
Posteriormente se tiene que calcular los 0,5 ml que habían sido añadidos
de plasma o suero sanguíneo para poder obtener el porcentaje de proteínas
presentes en su totalidad.
0,5 ml de suero 58,75 mg de proteínas
100 ml de suero X
X = (100 ml de suero) x (58,75 mg de proteínas)
(0,5 ml de suero)
X = 58,75 mg de proteínas
X = 11.750 mg de proteínas
7. El resultado se expresa en gr/dl por lo que se realiza una conversión de
unidades para la obtención de lo requerido:
,
3º. Cantidad de albumina en la solución X2.
De la misma manera que con la solución X1, se calcula los mg de proteínas
mediante la extrapolación de la misma en la curva de calibración. La absorbancia
de X2 es de 0,380 por lo que el valor de su concentración es de 5,80 mg.
Se calcula la cantidad de albúmina en la muestra inicial de 10 ml de los cuales
se extrajo 4ml de solución.
4 ml de solución 5,80 mg de albúmina
10 ml de solución X
X = (10 ml de solución) x (5,80 mg de albúmina)
(4 ml de solución)
Posteriormente, al añadirse los 0,5ml de plasma, se tiene que:
0,5 ml de suero 14,50 mg de albúmina
100 ml de suero X
X = (100 ml de suero) x (14,50 mg de albúmina)
(0,5 ml de suero)
Se expresa el valor en gr/dl de la siguiente manera:
,
X = 14,50 mg de albúmina
X = 2.900 mg de albúmina
8. 4º. Cantidad de globulinas precipitadas por diferencia.
La cantidad de proteínas totales en el suero equivale a la sumatoria de las
cantidades de albumina y globulinas en la muestra; el primer dato es conocido y la
cantidad de proteínas totales también, por lo que se despeja las globulinas de la
ecuación formada y dará el resultado deseado.
Proteínas totales = albúmina + globulinas.
Globulinas = proteínas totales – albúmina.
Globulinas = 11,75 gr/dl – 2,90 gr/dl.
Globulinas = 8,85 gr/dl
5º. Relación albumina/globulina (A/G)
Albúmina/Globulinas = 2,90 gr/dl = 0.328 gr/dl
8,85 gr/dl
Porcentaje de albúmina:
11,75 gr/dl de proteínas totales 100%
2,90 gr/dl de albúmina X
X = (2,90 gr/dl de albúmina) x (100%)
(11,75 gr/dl de proteínas totales)
X = 24,68%
9. Porcentaje de globulinas:
11,75 gr/dl de proteínas totales 100%
8,85 gr/dl de globulinas X
X = (8,85 gr/dl de globulinas) x (100%)
(11,75 gr/dl de proteínas totales)
Porcentaje de proteínas totales:
Proteínas totales = 75,32% + 24,68%
Proteínas totales = 100%
A continuación se presenta un cuadro comparativo de los valores normales
en relación con los valores obtenidos de proteínas presentes en el suero
sanguíneo o plasma humano.
Proteínas Valores
normales
Valores obtenidos Apreciación
Totales 6,0 - 8,4 11,75 Alto
Albúminas 3,5 - 5,5 2,90 Bajo
Globulinas 2,5 - 3,69 8,85 Muy Alto
Albúminas/Globulinas 1,3 – 1,7 0,328 Muy Bajo
X = 75,32%
10. Discusión de los resultados.
Después de la realización de la práctica de laboratorio y la obtención de los
resultados pudimos lograr el estudio de las proteínas que componen el plasma
sanguíneo, como lo son la albumina y las globulinas.
A altas fuerzas iónicas, la solubilidad de las proteínas disminuye, este
fenómeno es conocido como “salting out”. Este fenómeno se da básicamente por
la competencia que establece la sal Na2SO4 con la proteína por el agua logrando
sacar la capa de solvatación quedando las cargas de las proteínas libres, trayendo
como consecuencia que estas se atraigan y se aglomeran logrando la
precipitación de las globulinas; esto también, es debido a que la sal estaba en una
concentración saturada. Culminada esta etapa se extrajo cierta cantidad de
proteínas para determinar el total que poseía la solución inicial, mientras que se
tomaba otra cantidad para llevar al centrifugado y observar el componente de
albúmina que poseía. En este último se le añadió Éter dietílico como solvente
orgánico para provocar a precipitación de los componentes de la solución.
Notoriamente se observó cómo quedó precipitada las globulinas entre la albumina
que se encontraba por debajo de ella y el éter que estaba por encima.
A través del método colorímetro de Biuret se cuantifica las proteínas totales
y de albumina presentes en la muestra, en el que mientras más oscura la
coloración de la muestra mayor la concentración de proteínas. La centrifugación y
el baño de maría sirven de “catalizadores” de la reacción. El fotocolorímetro
permite cuantificar en función de la longitud de onda la reciprocidad que existe
entre los valores de una misma magnitud fotométrica en relación a dos haces de
radiaciones; arrojó los valores de la absorbancia que se usaron como punto de
partida para realizar la gráfica, que, con valores ya determinados y a partir de una
serie de ecuaciones matemáticas se logró determinar los gr % de albúmina y
proteína y los valores porcentuales de estas y las globulinas.
Se pueden considerar valores correspondientes aproximados de un
Proteinograma para determinar el total normal de albúmina y globulinas. El
proteinograma es un examen que busca hacer una cuantificación aproximada de
11. los tipos de proteína en la parte líquida (suero) de una muestra de sangre.
Correspondiente a esto los valores regulares son:
Proteínas Valores
normales
Valores obtenidos Apreciación
Totales 6,0 - 8,4 11,75 Alto
Albúminas 3,5 - 5,5 2,90 Bajo
Globulinas 2,5 - 3,69 8,85 Muy Alto
Albúminas/Globulinas 1,3 – 1,7 0,328 Muy Bajo
Al considerar estos valores se puede observar que los datos de proteínas
totales, albumina y globulinas obtenidos en el laboratorio se encuentran alterados
por lo que se puede inferir que el individuo en cuestión presenta alguna patología
relacionada con el aumento y la disminución de los valores de proteínas totales en
el plasma.
Luego de decir esto, los resultados obtenidos en el laboratorio observamos
que el porcentaje de albúmina presente en la solución de proteínas totales es de
un 24,68%.
Según Harper Bioquímica Ilustrada “La albúmina (69 kDa) es la proteína
principal del plasma humano (3,4 a 4,7 g/dL) y constituye aproximadamente 60%
de la proteína plasmática total. Alrededor de 40% de la albúmina está presente en
el plasma y el otro 60% existe en el espacio extracelular.” (pág. 614).
La albúmina presente en la solución estudiada es menor en una diferencia
de ±35% en relación al 60% que debe existir en el plasma humano. Demostrando
que hay una deficiencia de albúmina con respecto a la cantidad de globulina, que
en valores normales es de 38% y en concordancia a la muestra estudiada se tiene
un porcentaje de 75,32% para la globulina. Podemos entender que existe mayor
cantidad de globulina y una deficiencia de albúmina, es decir, los valores no
corresponden a un patrón normal de relación albúmina-globulina.
La importancia de la albúmina en la nutrición se debe a que es una proteína
que puede ser fácilmente metabolizada; una de sus funciones importantes es la de
servir como transportadora de diferentes moléculas en el torrente sanguíneo, tanto
12. orgánicas como inorgánicas; así como también es la principal responsable de que
se mantenga la presión oncótica, es decir la presión osmótica coloide, y al
disminuir estos valores ocasiona edemas.
Existen patologías o síntomas que llevan una relación con un bajo número
de albúmina. Por ejemplo el plasma de aquellos pacientes que padecen alguna
enfermedad hepática muestra un declive en la relación albúmina-globulinas, es
decir, una relación de albúmina-globulina disminuida, ya que dicha proteína es
sintetizada en el hígado. De igual forma hay una síntesis menguada en forma
relativamente temprana en condiciones de malnutrición proteica como es el
kwashiorkor, que es una enfermedad que se produce en niños por la ausencia de
nutrientes, como las proteínas en la dieta.
Por su parte podemos destacar que los niveles de las globulinas, tomando
en consideración los valores obtenidos en la práctica, están por encima de 3.69
g/dl. Esto suele deberse, fundamentalmente, a un problema de deshidratación;
esta elevación de las Globulinas en general se observa en estados de defensa
contra agentes infecciosos. Las consecuencias de un aumento de las globulinas
en sangre puede ocasionar enfermedades como enfermedad hepática crónica,
además tienen una serie de riesgos como sangrado excesivo, desmayo o
sensación de mareo, hematoma (acumulación de sangre debajo de la piel),
infección, etc.
13. Conclusión.
Las proteínas se necesitan para la mayoría de las funciones normales del
cuerpo, como el mantenimiento, crecimiento, reproducción, lactación y producción
de pelo. El déficit de proteína en la dieta reduce las reservas en sangre, hígado y
músculos y predisponen a los animales a padecer una variedad de enfermedades
graves o incluso fatales.
Durante el desarrollo de la práctica realizada se procedió aplicar los
principales métodos que se usan en el laboratorio para precipitar y separar
proteínas, así como métodos especiales para cuantificarlas y de esa forma saber
en qué cantidades se encuentran presentes en una solución determinada, en
especial la solución usada en la experiencia de laboratorio, el “plasma o suero
humano” a través del cual se estudiaron sus proteínas más importantes, la
albúmina, las globulinas y la relación que existe entre ellas.
El plasma está constituido por una serie de proteínas, como la
Albúmina y Globulina que desempeñan funciones vitales en el organismo. La
purificación de estas, puede ser lograda mediante la utilización de una serie de
técnicas de separación, tales como el Salting-Out que es la técnica más común de
precipitar proteínas y el método de fotocolorímetro de Biuret con el cual se puede
estimar cuantitativamente las proteínas totales y albúmina presentes en la
muestra.
A través de la separación de las proteínas, por medio de la curva de
calibración se pudo observar que durante el experimento realizado, que se
obtuvieron valores anormales con respecto a los estándares, esto puede ser
debido a la presencia de alguna patología en el organismo, como también a un
error experimental o a alguna falla en la ejecución de la práctica; aun así se
analizaron los resultados en base a los resultados obtenidos siguiendo las
patologías que se pudieran presentar si estos valores fueran los correctos, sin
embargo para estar seguro de ello, se deberá en tal caso, realizar de nuevo todo
el proceso para luego así dar un diagnóstico seguro en caso de que lo amerite.
