Método, Procedimiento y resultados en determinación de Benzodiazepinas . Toxicologia II

1. UNIVERSIDAD CATOLICA LOS ANGELES DE CHIMBOTE
FACULTA DE CIENCIAS DE LA SALUD
ESCUELA DE FARMACIA Y BIOQUIMICA
CURSO : TOXICOLOGIA II
DOCENTE : Q.F MANUEL HERNANDEZ AGUILAR.
TEMA : DETERMINACION DE BENZODIACEPINAS
ALUMNA :
 Huanambal Guevara, Flor Liliana
TRUJILLO - PERÚ
2013

2. I. INTRODUCCION
Las Benzodiacepinas son psicotrópicos que actúan sobre el SNC utilizados como
para la el tratamiento de la ansiedad, insomnio. A pesar de que el uso clínico
también pueden causar tolerancia, dependencia y adicción. Las muertes por BZD
son extremadamente raras, a no ser que se ingieran con otros fármacos como
barbitúricos, etanol y antidepresivos (1).
Para identificar si una persona ha consumido o no Benzodiacepinas se realiza un
análisis toxicológico realizando un screening toxicológico en muestras biológicas
(orina), consistente en una investigación o análisis general que tiene por finalidad
confirmar o descartar la presencia de sustancias toxicas (2).
Para la obtención del
extracto seco, el proceso de extracción que se realiza es por decantación, este
proceso se puede repetir varias veces para tener un mejor producto luego a este se
le aplica un método de investigación como CCF (3).
La cromatografía es una técnica que consiste en la separación de una mezcla de
dos o más compuestos Todas las técnicas cromatográfica dependen de la
distribución de los componentes de la mezcla entre dos fases inmiscibles: una fase
móvil, llamada también activa, que transporta las sustancias que se separan y que
progresa en relación con la otra, denominada fase estacionaria. La fase móvil
puede ser un líquido o un gas y la estacionaria puede ser un sólido o un líquido.
OBJETIVOS:
 Obtención de extracto seco por método Screening
 Identificar metabolitos tóxicos de BZD en muestra biológica de Orina.
 Aplicar la técnica de cromatografía en capa fina para la identificación de
sustancias toxicas.

3. II. MATERIALES Y REACTIVOS
MATERIALES:
 Vaso de precipitación
 Mechero
 Pinza
 Tijera
 Soporte universal
 Pera de decantación
 Papel tornasol
 Pipeta
 luna de reloj
 pipeteador
 viales de vidrio
 capilares
REACTIVOS:
 Cloroformo
 mL NH4OH al 10 %
 Metanol
 Agua Destilada
 HCl al 10 %
 Acetona
 Trietanolamina
 Ácido Acético Glacial
III. PROCEDIMIENTO:
OBTENCION DEL EXTRACCTO SECO.
1. Se toma 10 mL de orina en un vaso de precipitado.
2. Se agrega 10 mL HCl al 10 % para acidificar la muestra y mejorar el proceso
de extracción
3. Se homogeniza con una varilla y se lleva a baño maría a 60 °C por 30 min.
4. Se saca del baño maría y se deja enfriar a T° ambiente, luego filtramos.
5. El filtrado se agrega a la pera de decantación y se agrega 10 mL de
cloroformo, se mezcla suavemente y se deja separar.
6. Una vez separado las fases se extrae: la fase orgánica se coloca en un vial
previamente rotulado para evitar confusiones.

4. 7. Se extrae la fase acuosa a la cual le agregamos 10 mL NH4OH al 10 % para
alcalinizar la muestra y obtener metabolitos tóxicos en medio básico, para
confirmar que este en medio básico utilizamos el papel tornasol rojo pasa
de rojo a azul al cambiar de estado ácido a alcalino.
8. Agregamos 10 mL de cloroformo a la mezcla suavemente y se deja separar.
9. Después de separar las fases extraemos la fase orgánica y se coloca en un
vial previamente rotulado.
10. Seguidamente se coloca a desecar los productos obtenidos.
INVESTIGACION EN CROMATOGRAFIA EN CAPA FINA
1. Luego de haber desecado la muestra, se agrega el diluyente por las paredes
del vial que el extracto seco.
2. Seguidamente en la placa cromatografía previamente cortada y rayada se
realiza el sembrado con un capilar.
3. Esta placa se coloca en el vaso de precipitado que contiene el medio
(metanol, acetona, trietanolamina) para realizar el corrido.
4. Se espera que el solvente recorra el 80 % de la placa.
5. Luego se retira la placa y se deja secar.
6. Después de haber secado la placa cromatografíca se procede a realizar el
revelado
7. El revelador se coloca en un spray para revelar
8. Luego aplicar con el spray el revelador Dragendorff en la capa
cromatográfica
9. Luego se observa : si hay presencia o no de BZD (positivo forma de media
luna y se manifiestan como manchas de color naranja intensa sobre un fondo
naranja más claro)

5. IV. ESQUEMA DEL PROCEDIMIENTO Y RESULTADOS
Muestra
0rina 10 mL
Muestra + HCl se
homogeniza
Se agrega 10 mL
HCl al 10 %
Se saca del BM y se
deja enfriar a T°
Ambiente.
Filtramos
Se agrega 10 mL
cloroformo + la
muestra filtrada
La fase
orgánica se
coloca en un
vial
Fase
Acuosa
La fase
orgánica se
coloca en un
vial
La fase Acida La fase Básica
Obtención del extracto
seco
Acida Básico
Se lleva a la estufa a
100 °C para desecación

6. CORMATOGRAFIA EN CAPA FINA CCF
 PROCEDIMIENTO PARA LA PREPARACIÓN DEL DILUYENTE
Metanol : Acetona
2mL 2mL
 SEMBRADO DE LA PLACA CROMATOGRÁFICA
Acetona 2mL
+
Metanol 2mL
Extracto seco +
diluyente
Placa Cromatográfica
Sembrado de la
Placa Cromatográfica
Colocamos el
sembrado en el medio
Esperamos el 80 %
recorrido de la placa
Sacamos la placa del
medio y dejamos secar
Luego de aplicar el spray con el
revelador no se observó manchas de
naranja intenso en forma de media luna
que indica para de BZD solo se observó
un fondo color naranja claro.

7.  PROCEDIMIENTO PARA LA PREPARACION DEL MEDIO
Metanol : Acetona : Trietanolamina
1ml 1mL 0.05mL – 0.1 mL
20 mL 20 mL 0.1 mL
 PROCEDIMIENTO PARA LA PREPARACION DEL REVELADOR DE DRAGENDORFF
A B
- Pesar 0.85mg de sub nitrato de bismuto - Pesar 8gr de KI
- 10 mL de ácido acético glacial - 20 mL de agua destilada
- 40 mL de agua destilada
Procedimiento:
Diluir el sub nitrato de nitrato
con agua destilada, luego
agregamos el ácido acético
glacial.
Procedimiento:
Diluir el KI con agua
destilada.
A B HAG H2O
1 1 2 5
5 5 10 25
5mL de A +
5mL de B+
10mL HAG +
25 mL H20
Metanol 1mL +
Acetona 1mL+
Trietanolamina 0.1 mL
Reactivo Dragendorff

8. V. DISCUSION
La muestra biológica (orina) es válida para la identificación de posibles metabolitos
tóxicos.
El método Screening para determinación de BZD es válido, sin embargo el
resultado obtenido en la práctica fue negativo esto se debe a diversos factores
como:
 La muestra estuvo contaminada
 Error del operador por mala manipulación de la muestra
 Los materiales utilizados estuvieron contaminado con otras sustancias
La CCF es una técnica analítica y tiene como objetivo el análisis de una mezcla de
componentes, se desarrolla rápidamente debido a su simplicidad y velocidad, para
el análisis cualitativo de los productos de una reacción, puesto que permite
conocer de manera rápida y sencilla los componentes que hay en una mezcla.
El Rf se puede determinar para cada una de las manchas el valor de Rf (factor de
retención), o la distancia que cada compuesto se desplaza en la placa. Cada
compuesto tiene un Rf característico que depende del disolvente empleado y del
tipo de placa de CCF utilizada, pero es independiente del recorrido del disolvente.
De esta manera se puede ayudar a identificar un compuesto en una mezcla al
comparar su Rf con el de un compuesto conocido (preferiblemente cuando se
hacen eluir en la misma placa de CCF) (5)
.
VI. CONCLUSIONES
 Se obtuvo el extracto seco por el método Screening
 Se preparado el revelador de Dragendorff
 Se preparó el medio para el recorrido de la placa
 Se preparó el diluyente
 Se realizó la investigación de metabolitos tóxicos en cromatografía en capa
fina, el resultado fue negativo, no se observó la presencia de BZD en la
muestra de orina.
 Se analizó una muestra de orina tanto drogas de carácter ácido como básico,
por lo tanto se procedió a realizar una extracción en medio ácido, y de la fase
acuosa que resultó de esta extracción, se procedió a alcalinizar y realizándose
otra extracción para obtener la fracción básica.

9. VII. RECOMENDACIÓNES
Es importante tener en cuenta que para realizar un análisis de metabolitos
benzodiacepinicos en muestras de orina, se debe conocer la solubilidad, el
metabolismo de cada BZD y contar con los materiales y equipos necesarios, así
como también de sustancias de referencia de metabolitos con el fin de obtener
resultados precisos y confiables.
La extracción liquido-liquido es una técnica muy utilizada por lo que uno de los
factores a tener en cuenta para este tipo de extracción es la reelección del
solvente adecuado es la densidad, la polaridad, selectividad y la solubilidad de
la droga (4)
REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS
1. Gómez. Intoxicación por Benzodiacepinas. Departamento de toxicología
de la Universidad de Antioquina. Capitulo VIII. 1275-1277.
2. Camargo F. Screening toxicológico de sustancias psicoactivas en
muestras biológicas. Instituto Medido Forense. Argentina. 2010.
3. Fiorenza G. Manual De Procedimientos Analíticos Toxicológicos Para
Laboratorios De Baja Complejidad. Argentina. 2007
4. Villalobos M. implementación de un método de análisis por
cromatografía de metabolitos de BZD en muestras de orina. Universidad
Industrial de Santander. Colombia. 2004.
5. http://www.ub.edu/oblq/oblq%20castellano/cromatografia_tipus.html