La investigadora de COPAS Sur-Austral, Allisson Astuya presenta la charla "Compuestos tóxicos producidos por floraciones algales: desafíos y estrategias metodológicas para su detección" durante el Simposio "Marea Roja en un Océano Cambiante", el cual se realiza en el marco del Austral Summer Institute XIX, ASI-XIX de la Universidad de Concepción https://www.youtube.com/watch?v=_zJC5JV5T4M

1. COMPUESTOS TÓXICOS
PRODUCIDOS POR FAN:
Desafíos y estrategias
metodológicas para su detección
Dra. Allisson Astuya
Simposio “Marea Roja en un Océano Cambiante”
Concepción, 9 de enero del 2019

2. Marea Roja

4. Problemática de las biotoxinas marinas
 Los sistemas de vigilancia están diseñados
para:
 La protección del consumidor
 Fortalecer el desarrollo del sector de
producción dando cumplimiento a las
exigencias internacionales
La investigación tiene un papel clave
Flujo de toxinas en la
CADENA TRÓFICA

5. Toxinas conocidas y asociadas a los eventos FANs
Veneno Amnésico de moluscos VAM
Veneno Paralizante de molusco VPM
Veneno Diarreica de molusco VDM
Veneno Neurotóxico de molusco VNM
Veneno Spiroimine de molusco VSM
Veneno Ciguatera de peces VCP
Veneno Azaspiracid de moluscos VAZM
Se han clasificado de acuerdo sus efectos tóxicos sobre vertebrados (incl. humanos):
5 Sindromes tóxicos de
moluscos que ocurren en Chile

6. Clase Ejemplo LD50 (mg/kg)
I.- Súper tóxico Tetraclorodibenzodioxina 5
II.- Extremadamente tóxico Pictrotoxina 5-50
III.- Muy tóxico Fenobarbital 50-500
IV.- Moderadamente tóxico Morfina 500-5000
V.- Levemente tóxico Etanol 5000-15000
Toxicidad
Clase LD50 (mg/Kg)
Saxitoxina (VPM) 0.01
Tetrodoxina (VNM) 0.01
Ciguatoxina (VCM) 0.00035
Acido Okadaico (AO) 0.2
Ácido Domoico (AD) 2.9 - 4.9
Súper Tóxico!!!!

7. Límites Regulatorios
 Los niveles regulatorios para biotoxinas están establecidos en el Reglamento Sanitario de los Alimentos:
ARTÍCULO 333.
 Los mariscos no podrán contener:
 80 ug eq /100 g (VPM)
 20 ug eq/100g (VAM)
 Ser positiva la prueba del bioensayo para toxina diarreica de los mariscos (VDM).
 BIOTOXINAS MARINAS LIPOFÍLICAS (BML):
 - Grupo Ácido Okadaico (AO) + Grupo Pectenotoxinas (PTXs): 160 µg Equivalentes AO/Kg
- Grupo Azaspirácidos (AZAs): 160 µg Equivalentes AZA/Kg
 - Grupo Yesotoxinas (YTXs): 3,75 mg Equivalentes YTX/K
No se encuentran reguladas iminas cíclicas, espirolidosy palitoxinas
Últimos eventos FANs VPM en mariscos superan los 12000 ug/100g carne
Andrea Rivera et al. Minsal-ICHA 2018

8. Veneno paralizante de moluscos (VPM)
N
N N
H
H
N
NH2
R4
R5
OH
H2N
1
2 4
6
7
9
10
12
13
R1
R2
R3
Alexandrium catenella
Pyrodinium bahamense
Gymnodinium catenatum
Photo: Cawthron
Lyngbya wollei

9. O
O
O
O
O
O
O
O
O
O
O
-
O3SO
Me
H
H
Me
H
H
Me
Me
Me
HHHHH
Me H H H H
H
H
H
H
H
H
HO
-
O3SO
OH
Protoceratium
reticulatum
Yessotoxins
O
O
O
O
O
O
O
O
OH
O
OH
OH
O
O
A
B
C
D
E
F
7
14
33 43
1
34
NH
O
O
O
O
OO
O
O
OH
O
OH
HO
Amphidoma languida
Pseudonitzschia spp
A. catenella
PSP toxins
Alexandrium
ostenfeldii
O
O
N
O
O
O
OH
HO
2
3
31
13
Cycloimines
Domoic acid
Azaspiracids
Pectenotoxins
Dinophysis spp
HO
O
O
OH
O
O O
O
OOH
OH
OH
O
Okadaic acid, Dinophysistoxins
Especies FANs más comunes y sus toxinas
Gentileza, Bernd Krock

10. VPM
(SXT)
NO CONSIDERAN EL EFECTO
BIOLÓGICO
RUTINARIOS
Programas de Vigilancia
DESARROLLO DE MÉTODOS TOXICOLÓGICOS
ALTERNATIVOS o COMPLEMENTARIOS

11. Ensayos funcionales in vitro para la detección de
toxinas marinas
Toxinas
marinas
Cambios en el perfil de expresión
Real time PCR, Secuenciación
masiva, GEN-FOS-LUC
Cambios en los patrones
electrofisiológicos, potencial de
membrana, corrientes, voltajes
(Patch clamp)
Cambios en el perfil de proteínas, liberación,
Radio inmunoensayos, ELISA
In
out
núcleo
Viabilidad Celular MTT , Azul de tripan,
Rojo Neutro (espectrofotométrico).
Cambios en el Citoesqueleto
(F-actina)Banerjee et al. 2013. Toxins

12. Veneno paralizante de moluscos (VPM)

13. Bioensayo Celular para el screening de VPM basado en rescate
celular en Neuro2a
•Control +O/V: 0% efecto
•Dosis máxima: 100% efecto

14. Detección de toxinas paralizantes puras Factor de Toxicidad Equivalente (TEF)
Aballay et al. ICHA 2018
Desafíos:
1.- Selección de método extracción
Disminución del Efecto Matriz
Validación: Análisis de muestras complejas naturalmente contaminadas
Muestras negativas detectadas con ensayo neuro-2a.Muestras positivas detectadas con ensayo neuro-2a.

15. Búsqueda de marcadores moleculares de toxicidad saxitoxina
Rivera A. et al ICHA 2018

16. Ictiotoxinas?

17. Curva dosis-respuesta de Heterosigma akashiwo
(HaTX) usando el ensayo citotóxico con Neuro-2a
HaTx induce silenciamiento de la transmisión sináptica HaTx induce silenciamiento comparación con TTX
Nueva toxina paralizante en Heterosigma Akashiwo (HATx)
Astuya A et al 2015

18. Efectos asociados a especies tóxicas
10m
20m
Alexandrium catenella
strain 2 (Alex2)
Rhodomonas salina
Efecto Lítico
Video: gentileza U. Tillmann
Rhodomonas salina exposed to A. catenella supernatant (cell free)

19. Por qué mueren los peces? Nuevas hipótesis “Ictiotoxinas”
Granelli et al.2001,2005

20. Factores Bióticos:
Competencia
Factores Abióticos:
Ej. Variación Tº - salinidad
Efecto Ictiotóxico es un
efecto colateral de la
guerra química?
Efectos Alelopáticos
Stress

21. Desarrollo de nuevas aproximaciones para evaluación de Ictiotoxinas en
modelo in vitro
Supernatant
(free cell medium)
Fish Cells Fish Cells
CompuestosSolubles
desde co-cultivo
No directo y sobrenadantes
Células de Peces
evaluación
in vitro
Contacto Directo
Co-Cultivos
Contacto No Directo
Co-Cultivos
• Conteo Celular
• Morfología
• Sondas
• Integridad de membrana
• Cambios morfológicos
• Sondas
• qPCR
Sobrenadantes
Desde Co-Cultivos
libres de microalgas
Células de Peces Células de Peces
Co-Cultivos
H Akashiwo/A Catenella
16h 24h
Mono-Cultivos
A Catenella
Exp Est
16h 24h

22. Experimento1
CONTROL A: Tiempo de exposición48h
Experimento 2
3 horas post
fecundación
2 días post
fecundación
Eleuteroembrion
3 días post
fecundación
Larvas con absorción de vitelo
6-7 días post fecundación
CONTROL B: Tiempo de exposición 144h
CONTROLES : Tiempo de exposición 72h - 96h
E x tra c t c o n c e n tra tio n (m g *L
-1
)
Embryomortality(%)
0 2 5 5 0 1 0 0 2 0 0
0
2 0
4 0
6 0
8 0
1 0 0
*
*
E x tra c t c o n c e n tra tio n (m g *L
-1
)
Larvalmalformation(%)
0 2 5 5 0 1 0 0 2 0 0
0
2 5
5 0
7 5
1 0 0
K . v e n e fic u m H . a k a s h iw o
Extractos microalgales
Herramientas complementarias
Modelo Pez cebra Danio rerio
Estados tempranos
Mortalidad Malformaciones Alteraciones
motorasLlanos et al. ICHA 2018_ LbTx

24. Nacionales
QA Luis Roa SGS
Dr Vet Andrea Rivera MINSAL
QF Lorena Delgado ISP
Dr. Benjamín Suárez Uchile-LabTox
Dr. Nestor Lagos UChile
Dra. Alejandra Aguilera USS
IFOP
SUBPESCA, SERNAPESCA
VDRI-UdeC
FONDEF
FIC R 40000139
Internacionales
Dr. Bernd Krock AWI-Alemania
Dra Helene Hegaret CNRI-Francia
Dr. Jorge Diogenes IRTA-España
Dra. Mónica Cámpas IRTA-España
Dr. Botana U Sant Compostela-Esp
FiSH Tox 2019
Agradecimientos

25. MUCHAS GRACIAS
www.sur-austral.cl

26. Detección de toxinas lipofílicas en Neuro2a

27. Toxin R1 R2 R3 R4 R5 m/z Mass transitions
STX H H H
(Carbamoyl-)
OH 300 300 > 282, 300 > 204
NEO OH H H OH 316 316 > 298. 316 > 196
GTX1 OH H OSO3
- OH 412 412 > 332, 412 > 314
GTX2 H H OSO3
- OH 396 396 > 316, 396 > 298
GTX3 H OSO3
- H OH 396 396 > 316, 396 > 298
GTX4 OH OSO3
- H OH 412 412 > 332, 412 > 314
B1 (GTX5) H H H
(N-Sulfocarbamoyl-)
OH 380 380 > 300, 380 > 282
B2 (GTX6) OH H H OH 396 396 > 316, 396 > 298
C3 OH H OSO3
- OH 492 412 > 332, 412 > 314
C1 H H OSO3
- OH 476 396 > 316, 396 > 298
C2 H OSO3
- H OH 476 396 > 316, 396 > 298
C4 OH OSO3
- H OH 492 412 > 332, 412 > 314
dc-STX H H H
-OH
(Decarbamoyl-)
OH 257 257 > 239, 257 > 156
dc-NEO OH H H OH 273 273 > 255
dc-GTX1 OH H OSO3
- OH 369 369 > 289
dc-GTX2 H H OSO3
- OH 353 353 > 273, 273 > 255
dc-GTX3 H OSO3
- H OH 353 353 > 273, 273 > 255
dc-GTX4 OH OSO3
- H OH 369 369 > 289
Mass Spectrometry of PSP Toxins
O NH2
O
O NH
O
S
O
OO
-
Veneno Paralizante de Mariscos