Efecto de la sepsis sobre el suministro de sustratos para la formación hepática de triglicéridos.

1. Proyecto de Investigación Departamento Fisiología UPV/EHU.
3º Grado de Medicina UPV/EHU 13/02/2017
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Efecto de la sepsis sobre el suministro de
sustratos para la formación hepática de
triglicéridos.
-Patxi Santaolalla. -Alberto Ugedo.
-Gorka Pinedo. -Carlos Uchuari.

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Antecedentes:
La sepsis es un proceso inflamatorio
generalizado y masivo que se
desencadena ante la presencia de
microorganismos patógenos en sangre y
que se manifiesta en la forma del
síndrome de respuesta inflamatoria
sistémica (SRIS).
La sepsis es un problema real que
presenta una incidencia mundial de 18
millones de casos al año [1]. Por
ejemplo, en los EE.UU la sepsis afecta a
3 de cada 1.000 personas [2] y la sepsis
grave produce más de 200.000 muertes
al año [3].
1. Mecanismo del SRIS:
El Síndrome de Respuesta Inflamatoria
Sistémica (SRIS) provocado por la
sepsis tiene lugar cuando el LPS
bacteriano es reconocido por los
receptores tipo Toll 4 del macrófago
produciendo una inmensa liberación de
citocinas pro-inflamatorios (TNF e IL-
6, principalmente) provocando una gran
activación de la respuesta inflamatoria
[4].
Estas citocinas además de activar la
respuesta inflamatoria desencadenan
otras acciones que intervienen en el
SRIS: aumenta de forma directa la
lipólisis del tejido adiposo, aumentan la
liberación de catecolaminas y activan el
eje hipotálamo-hipófisis-médula
suprarrenal promoviendo la liberación
de cortisol.
2. Estado de Inanición-simil:
Por otro lado, el SRIS genera en el
individuo un estado de inación-simil al
disminuir las necesidades de
alimentación debidas al gran aumento
de la secreción de leptina y de cortisol.
Este nuevo estado de inación promueve
un aumento de la secreción de glucagón
que afectará al metabolismo del
individuo.
El SRIS requiere una redistribución de
los sustratos para que los componentes
celulares del sistema inmune puedan
suplir las altas necesidades energéticas
que conlleva la síntesis de los
mediadores de la inflamación y poder
hacer frente a la infección. Es decir, la
sepsis desencadena en el organismo un
estado catabólico generalizado debido a
la gran necesidad energética que
requiere el individuo para hacer frente
al proceso infeccioso. [5]. Además,
como ya se ha dicho, en un proceso de
sepsis nos encontramos con una
situación metabólica análoga a la
inanición ya que le SRSI provoca en el
individuo un estado metabólico similar
al ayuno[6-8].
3. Redistribución de los componentes
celulares en la sepsis:
3.1 Lípidos:
Dentro de este estado catabólico
generalizado, la lipolisis del tejido
adiposo adquiere una importancia
capital ya que es la principal, y casi
única fuente de energía, accesible del

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enfermo debido al estado de inanición al
que está sometido [9].
De esta manera, en el suero de un
individuo con sepsis encontramos una
gran cantidad de productos provenientes
de esta lipólisis tales como el glicerol y
los ácidos grasos [7]. Uno de los tejidos
a los que llegan estos productos es el
higado, órgano central en la respuesta
inmune inducible (principal productor
de las proteinas de fase aguda) y en el
aporte energético durante la respuesta
inflamatoria [10]. El glicerol del suero
accede al hígado mediante la
aquaporinas 7 [11] y los acidos grasos
por medio del transportador CD36 [12].
Por un lado, una vez dentro de los
hepatocitos al glicerol se le añadirá una
molécula de fosfato en uno de sus
carbonos terminales por medio de la
enzima glicerol quinasa. A este glicerol
será al que posteriormente se le enlacen
los ácidos grasos.
Por otro lado, los ácidos grasos
transportados mediante la CD36 sufren
un proceso de activación por medio de
la Acil-CoA-sintetasa. Por otro lado, el
glicerol una vez dentro del hepatocito,
queda fosforilado por medio de la
enzima glicerol-quinasa dando lugar al
glicerol-3-P. A este sustrato se le irán
añadiendo distintos ácidos grasos
previamente activados en diferentes
átomos de carbono por medio de acil-
transferasas. En primer lugar, el
glicerol-3-P se transforma en ácido
lisofosfatídico al añadírsele un ácido
graso en el carbono 1 (C1) mediante la
glicerol-3-fosfato-aciltransferasa.
Seguidamente, se añade otro ácido
graso en el C2 mediante la 1-acil-
glicerol-3-fosfato-aciltransfersa
obteniendose así el ácido fosfatídico al
cual posteriormente se le eliminará el
grupo fosfato de la posición 3 mediante
la fosfatasa de ácidos fosfatídicos (PAP)
dando lugar al 1,2-diacilglicerol. Este
diacilglicerol a continuacíón se
transforma en un 1,2,3-triacilglicerol
mediante la 1,2-diacilglicerol-
aciltransfersa al añadir el último ácido
graso. Mientras que el ácido graso
esterificado en el C1 suele ser un ácido
graso saturado, el ácido graso
esterificado en C2 suele ser insaturado.
Por su parte, el ácido graso esterificado
en C3 puede ser tanto insaturado como
saturado (figura 1).
3.2 Carbohidratos:
Por otro lado, para poder hacer frente a
la gran demanda de glucosa generada
por la gran activación del sistema
inmune, el organismo activa las rutas
metabólicas encargadas de la sintesis de
glucosa; estas son:
1. En primer lugar, el organismo
utilizará las reservas de glucógeno
hepático presentes para sintetizar
glucosa por medio de la glucogenolisis
hepática.
2. Posteriormente, en un estado más
avanzado de la enfermedad en el que las
reservas de glucógeno hepático se
hayan acabado, se realizará la
gluconeogénesis por medio de los
sustratos metabólicos disponibles en ese
momento: aminoácidos (alanina)
procedentes de la degradación proteica
del músculo, lactato, procedente de las
vías catabólicas anaerobios activadas en
el organismo (metabolismo muscular y

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eritrocitario) y el glicerol, proveniente
de la lipolisis del tejido adiposo.
Resumiendo, en el proceso de sepsis
nos encontramos con una redistribución
de los dos principales componentes
energéticos celulares: lipidos y
carbohidratos. (figura 2).
Por un lado, el glicerol y los ácidos
grasos libres aumentan debido al
aumento de la lipolisis. Por otro lado,
los precursores del piruvato
(aminoácidos y lactato) aumentan para
mantener los niveles de glucosa.
4. Papel de la DHAP:
Como se puede observar en la figura 2,
entre la vía de gluconeogénesis hepática
y la vía de síntesis de TG encontramos
un metabolito intermedio común a
ambas vías, la DHAP. Este metabolito
intermedio de la gluconeogénesis en
determinadas situaciones fisiológicas
(como es el caso de la glucólisis en el
tejido adiposo en el estado alimentado)
se transforma en glicerol-3P
contribuyendo a la síntesis de
triglicéridos. No obstante, en el estado
de sepsis se observa una disminución
del glicerol-3-P-deshidrogenasa; de lo
que se deduce que, el organismo en este
estado reserva los sustratos del piruvato
para la síntesis de glucosa [12 y 13] por
medio de la gluconoegénesis a partir del
piruvato. Es decir, en el estado de sepsis
el hepatocito disminuye la expresión de
la glicerol-3P-deshidrogenasas para
aprovechar el piruvato obtenido de la
degradación proteica muscular (alanina)
y del lactato para sintetizar glucosa.
5. Conclusiones del estudio
bibliográfico:
De todo lo anteriomente dicho se
concluyen dos cosas:
1. En un proceso de sepsis la síntesis de
triglicéridos en el hígado está
aumentada; siendo el glicerol y los
ácidos grasos los principales sustratos
metabólicos [14-16].
2. La implicación de la DHAP en la
síntesis de glicerol-3P está disminuida
reservandose los precursores del
piruvato para la síntesis de glucosa.
3. Toda esta inmensa cantidad de
triglicéridos sintetizados se utilizarán
para crear las VLDL necesarias para
suministrar energía a los tejidos
extrahepáticos además de aclarar el LPS
bacteriano y de intentar controlar la
Coagulación Intravascular Diseminada
(otro fenómeno característico de la
sépsis) [17]. Esta última acción la
llevarán a cabo junto con las HDL [18]
que adquieren una gran importancia al
presentar el LPS a los linfocitos
polimorfonucleares promoviendo la
respuesta inmune inflamatoria [19].
4. Este evento lipolítico generalizado
termina por desarrollar en el organismo
una hiperlipidemia (dislipemia); la cual
junto con las citocinas pro-inflamatorias
(TNF e IL-1) liberadas por la activación
de las células de kupffer ante el LPS,
acaba desencadenando un daño celular
en el hepatocito en forma de esteatosis
hepática (figura 2).

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Hipotesis:
La sepsis provoca en los hepatocitos un aumento de la síntesis de triglicéridos utilizando
como fuente los sustratos provenientes de la lipólisis del tejido adiposo.
Objetivos:
1. Investigar si la sepsis provoca cambios en la lipolisis del tejido adiposo en el estado
de ayuno.
2. Investigar el transporte de los ácidos grasos provenientes de la lipolisis del tejido
adiposo al interior de los hepatocitos.
3. Analizar el papel de los sustratos derivados de la lipólisis del tejido adiposo en la
síntesis de triglicéridos hepáticos.
4. Analizar el papel de los intermediarios del metabolismo de carbohidratos como
aporte de sustratos para la síntesis de triglicéridos en los hepatocitos.

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Hitos y Tareas.
Objetivo 1: Investigar si la sepsis provoca cambios en la lipolisis del tejido adiposo en
el estado de ayuno.
1º Hito: Analizar las concentraciones de AGL en el suero de ratas en sepsis y
ratas en ayuno.
Tarea 1: extraer suero de ratas Fa-LPS y ratas Fa-Fa.
Tarea 2: Determinación de la concentración plasmática de glicerol mediante la
utilización del kit comercial específico [20].
Tarea 3: Análisis estadístico de los resultados unsando la t de student de dos colas
para datos desapareados.
2º Hito : Analizar las concentraciones de glicerol en suero de ratas en sepsis y
ratas en ayuno
Tarea 4: extraer suero de ratas Fa-LPS y ratas Fa-Fa
Tarea 5: Determinación de la concentración plasmática de ácidos grasos libres
mediante la utilización del kit comercial específico.
Tarea 6: Análisis estadístico de los resultados unsando la t de student de dos colas
para datos desapareados.
Objetivo 2. Investigar el transporte de los ácidos grasos provenientes de la lipolisis del
tejido adiposo al interior de los hepatocitos.
3ª Hito: Estudiar el aumento de la entrada de ácidos grasos libres al
hepatocito en el proceso de sepsis mediante la cuantificación de la expresión
génica del transportador CD36.
Tarea 7: Extracción de RNA mediante el método del TRIzol a partir de
fragmanetos de hígados de ratones Fa-LPS y Fa-Fa .
Tarea 8: Cuantificación del RNA mediante espectrofotometría (nanodrop).
Tarea 9: Comprobación de la integridad del RNA extraído mediante electroforesis
en gel de agarosa.
Tarea 10: Tratamiento con DNAs I de la muestra de RNA.
Tarea 11: Síntesis de cDNA: SuperScript III First-Strand Synthesis System for
RT-PCR.
Tarea 12: Realizar PCR a tiempo real, mediante el uso del fluoróforo SMBR-
green.
Tarea 13: Análisis estadístico de los resultados unsando la t de student de dos
colas para datos desapareados.

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Objetivo 3: Analizar el papel de los sustratos derivados de la lipólisis del tejido adiposo
en la síntesis de triglicéridos hepáticos.
4º Hito: Analizar el papel del glicerol como sustrato preferente de la síntesis de
triglicéridos hepáticos en el proceso de sepsis mediante la cuantificación de la
expresión génica de la glicerol quinasa hepática.
Tarea 14: Análisis estadístico de los resultados unsando la t de student de dos colas
para datos desapareados.
Tarea 15: Cuantificación del RNA mediante espectrofotometría (nanodrop)
Tarea 16: Comprobación de la integridad del RNA extraído mediante electroforesis
en gel de agarosa.
Tarea 17: Tratamiento con DNAs I de la muestra de RNA.
Tarea 18: Síntesis de cDNA: SuperScript III First-Strand Synthesis System for RT-
PCR.
Tarea 19: Realizar PCR a tiempo real, mediante el uso del fluoróforo SMBR-green.
Tarea 20: Análisis estadístico de los resultados unsando la t de student de dos colas
para datos desapareados.
5º Hito: Analizar la transformación del glicerol-3-fosfato hepática a
triglicéridos mediante la cuantificaciòn la expresión génica de la fosfatasa de
ácidos fosfatídicos.
Tarea 21: Análisis estadístico de los resultados unsando la t de student de dos colas
para datos desapareados.
Tarea 22: Cuantificación del RNA mediante espectrofotometría (nanodrop).
Tarea 23: Comprobación de la integridad del RNA extraído mediante electroforesis
en gel de agarosa.
Tarea 24: Tratamiento con DNAs I de la muestra de RNA.
Tarea 25: Síntesis de cDNA: SuperScript III First-Strand Synthesis System for RT-
PCR.
Tarea 26: Realizar PCR a tiempo real, mediante el uso del fluoróforo SMBR-green.
Tarea 27: Análisis estadístico de los resultados unsando la t de student de dos colas
para datos desapareados.
6ª Hito: Analizar las concentraciones de triglicérido y diglicérido hepático.
Tarea 28: Extracción de lípidos del homogenado hepático previamente centrifugado
a 3000 de utilizando mezclas de disolventes orgánicos según el método de Folch
[21].
Tarea 29: Análisis de las distintas especies lipídicas mediante cromatografía en
capa fina siguiendo el método de ruiz y colls (TLC).
Tarea 30: Determinación de la concentración total de proteina total mediante el
método de Bradford [22].
Tarea 31: Identificación y cuantificación de la masa de las distintas especies
lipídicas en la muestra usando el software image J.
Tarea 32: Análisis estadístico de los resultados unsando la t de student de dos colas
para datos desapareados.

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Objetivo 4: Analizar el papel de los intermediarios del metabolismo de carbohidratos
como aporte de sustratos para la síntesis de triglicéridos en los hepatocitos.
7º Hito: Constatar la baja implicación de la DHAP como sustrato para la
síntesis de triglicéridos hepáticos mediante la expresión génica de la glicerol-3-
fosfato deshidrogenasa.
Cuantificar la expresión génica de la glicerol 3 fosfato deshidrogenasas.
Tarea 7: Extracción de RNA mediante el método del TRIzol a partir de fragmanetos
de hígados de ratones Fa-LPS y Fa-Fa .
Tarea 8: Cuantificación del RNA mediante espectrofotometría (nanodrop).
Tarea 9: Comprobación de la integridad del RNA extraído mediante electroforesis
en gel de agarosa.
Tarea 10: Tratamiento con DNAs I de la muestra de RNA.
Tarea 11: Síntesis de cDNA: SuperScript III First-Strand Synthesis System for RT-
PCR.
Tarea 12: Realizar PCR a tiempo real, mediante el uso del fluoróforo SMBR-green.
Tarea 13: Análisis estadístico de los resultados unsando la t de student de dos colas
para datos desapareados.

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AGL Glicerol
nM Fa/?
***
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0
20
40
60
80
100
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G-3P-DH
uA
Fa/?
Resultados:

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CD36 GK PAPPs
uA
Fa/?

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12
Bibliografía:
[1]. Lyle N.H., Pena O.M., Boyd J.H. y Hancock R.E., "Barriers to the effective
treatment of sepsis: antimicrobial agents, sepsis definitions, and host-directed
therapies", Ann NY Acad Sci 2014, 1323 (2014): 101-114. doi 10.1111/nyas.12444.
PMID 24797961.
[2]. Soong J. y Soni N., "Sepsis: Recognition and treatment", Clin Med 2012, 12 (3):
276-280. doi 10.7861/clinmedicine.12-3-276. PMID 22783783.
[3]. Munford R.S., “Severe Sepsis and Septic Shock”, cap. 271 en Longo D.L., Fauci
A.S., Kasper D.L., Hauser S.L. et al., Harrison's Principles of Internal Medicine, 18a
ed., Nueva York, McGraw-Hill, 2011, pp. 2223-2231.
[4]. P Leclercq, C Filippi, B Sibille, S Hamant… Inhibition of glycerol metabolism in
hepatocytes isolated from endotoxic rats. - Biochemical Journal Jul 15, 1997, 325 (2)
519-525"Furthermore glycerol kinase activity was increased by 33% (P < 0.01)"
[5]. DS Miranda Bases moleculares de la sepsis Revista Archivo Médico de Camagüey,
2014.
[6]. D. C. Morrison, R. J. Ulevitch. The effect of bacterial endotoxin on host mediation
system.N1513 Clinic and Research Foundation, La Jola,CA 92037. April 13,1978.
[7]. I. Hardardottir, C. Grunfeld and K. R. Feingold. Effects of endotoxin on lipid
metabolism. Biochemical Society Transactions. 1995. 23: 1013-1016.
[8]. Luxia Zu, Jinhan He, Hongfeng Jiang, Chong Xu, Shenshen Pu, and Guoheng Xu.
Bacterial Endotoxin Stimulates Adipose Lipolysis via Toll-Like Receptor 4 and
Extracellular Signal-regulated Kinase Pathway. J.Biol.Chemistry Vol .284, NO.9,
pp.5915–5926, February27,2009.
[9]. JJ Spitzer, GJ Bagby, K Mészáros. Alterations in lipid and carbohydrate
metabolism in sepsis. - Journal of Parenteral and Enteral Nutrition [1988, 12(6
Suppl):53S-58S
[10]. S. Castro. Manual de patología general. Elsevier Masson 7º Edición 2013.
Barcelona, España. Capitulos 10 y 11.
[11]. V Catalán, J Gómez-Ambrosi, C Pastor, F Rotellar…Influence of morbid obesity
and insulin resistance on gene expression levels of AQP7 in visceral adipose tissue and
AQP9 in liver - Obesity surgery, 2008 – Springer
[12]. A Berlanga, E Guiu-Jurado, JA Porras. Papel de las lipasas metabólicas y la
lipotoxicidad en el desarrollo de esteatosishepática y esteatohepatitis no alcohólica.
Clínica e Investigación. Elsevier 2016.
[13]. C Chambrier, M Laville, KR Berrada…Insulin sensitivity of glucose and fat
metabolism in severe sepsis - Clinical Science (2000) 99, 321–328

13. Proyecto de Investigación Departamento Fisiología UPV/EHU.
3º Grado de Medicina UPV/EHU 13/02/2017
13
[14]. P. Aspichueta, S. Pérez, B. Ochoa, O. Fresnedo. Endotoxin promotes preferential
periportal upregulation of VLDL secretion in the rat liver. JLR, February 16, 2005. DOI
10.1194/jlr.M500003-JLR200.
[15]. L. Arisqueta, M. Nuñez-Garcia, J. Ogando, I. Garcia-Arcos
1
, B. Ochoa, P.
Aspichueta, O. Fresnedo, Y. Rueda . Involvement of lipid droplets in hepatic responses
to lipopolysaccharide treatment in mice. Biochimica et Biophysica Acta 1831 (2013)
1357–1367.
[16]. Khovidhunkit, W., M-S. Kim, R. A. Memon, J. K. Shigenaga, A. H. Moser, K. R.
Feingold, and C. Grunfeld. Effects of infection and inflammation on lipid and lipo-
protein metabolism: mechanisms and consequences to the host. J. Lipid Res. 2004. 45:
1169–1196.
[17]. S. Castro. Manual de patología general. Elsevier Masson 7º Edición 2013.
Barcelona, España. Capitulos 32 pág. 251.
[18]. M. Levi, T. Van der Poll. Coagulation and sepsis. Thrombosis Research. 2017.
38–44.
[19] Susana Contreras-Duarte, Pablo Varas, Fernanda Awad, Dolores Busso y Attilio
Rigotti “Papel protector de las lipoproteínas de alta densidad en sepsis: aspectos básicos
e implicancias clínicas” Rev. chil. infectol. vol.31 no.1 Santiago feb. 2014
[20]. X. Buqué, P. Aspichueta. Protocolos y Reactivos de trabajo de laboratorio. 2017.
[21] Ayala Torres A.; Hernández Zarazúa I. L. Implementación de la técnica de folch
para la extracción de grasas en frío. Universidad Autónoma de Querétaro.
[22] A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of
protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 1976 May
7;72:248-54.
[23] Quantification in the subnanomolar range of phospholipids and neutral lipids by
monodimensional thin-layer chromatography and image analysis. J Lipid Res. 1997
Jul;38(7):1482-9.