Presentación8-Tipos de muerte celular.pptx

INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL
Escuela Nacional de Ciencias Biológicas (ENCB)
Departamento de Morfología
LAB. de Citopatología Ambiental
Curso: Cultivo de células, tejidos y órganos animales
Muerte celular: apoptosis, necrosis y autofagia. Caracteríticas morfológicas y moleculares
Técnicas para su análisis. Controles positivos.
EQUIPO 5: Susel Del Sol Fernández
María José Pérez Méndez
PROFESORA: Dra. Eva Román Gallegos
1
Muerte celular de monocitos. Nature Comunications

MUERTE CELULAR PROGRAMADA
MMECANISMOS DE MUERTE CELULAR PROGRAMADA
Muerte celular apoptótica
Intrínseca
Dependiente de caspasas
Extrínseca
Independiente de caspasas
Muerte celular no apoptótica
Autofagia Necroptosis
APOPTOSIS

Caspasas. Generalidades
Las procaspasas contienen tres dominios:
•un prodominio N-terminal,
•una subunidad grande (p20)
•una subunidad pequeña (p10) en el C-terminal.
 Enzimas que pertenecen a la familia de las cisteín proteasas y que cortan específicamente tras residuos de aspartato (de ahí
su nombre C-isteín asp-artato prote-asas)
 Todas las caspasas apoptóticas permanecen en las células normales como proenzimas inactivos, similares a los zimógenos
de la coagulación de la sangre.

Caspasas. Generalidades
La mayor parte de las caspasas se ubican
en el espacio intermembranoso
mitocondrial y de aquí son liberadas al
citosol ante un estímulo proapoptótico.
CASPASAS
Iniciadoras Ejecutoras
Su función está dirigida a la
activación de la cascada de
caspasas
caspasa 8: se activa por Fas
caspasa 9: se activa por apaf-1
caspasa 10: se activa por Fas y por TNFR1
actúan sobre proteínas del
citoesqueleto y de la matriz nuclear
produciendo rotura de estas
estructuras.
Tabla.1. Algunas caspasas humanas. (Alberts et al. 2010).
CARD (dominio de reclutamiento y activación de caspasas)
o DED(Dominio efectores de muerte)

Vías para la activación de caspasas durante la apoptosis
receptores de muerte en la membrana plasmática
Vía Extrínseca
Apoptosis Extrínseca
Vía Intrínseca
Cambios en la integridad de la mitocondria
Apoptosis Intrínseca
Fosfatidilserina (PS-R),
TNFR1,
FAS (APO-1/CD95) y
DR-4,-5 (receptores TRAIL)
• Son proteínas transmembrana que pertenecen a la superfamilia del TNF
• Conservan una región rica en Cys en sus dominios extracelulares, Fas y
TNFR comparten una región homóloga en sus dominios intracelulares
denominada dominio de muerte ("Death Domain“)necesario para la
transducción de la señal de suicidio celular.
• Los ligandos activadores de estos DR están estructuralmente relacionados
entre sí, perteneciendo todos ellos a la superfamilia de genes TNF

Ensamblaje
de DISC
ACTIVACIÓN Y
ESCISIÓN DE LA
PROCASPASA 8, 10 o
AMBAS
1- trimerización del
receptor inducida
por el ligando
Apoptosis Extrínseca. Mecanismo
Figura.1. Apoptosis Extrínseca. (Alberts et al. 2010).

Apoptosis Extrínseca. Mecanismo
http://diposit.ub.edu/dspace/bitstream/2445/36025/2/01.JMGM_INTRODUCCION.pdf

Apoptosis Intrínseca. Mecanismo
Estímulos de la vía intrínseca.
 Disminución de factores tróficos
• Factores de crecimiento
• Hormonas
• Citoquinas
 Agentes tóxicos
 Temperatura
 Cambios osmóticos
 Radiaciones UV, Rx, Gamma
 Hipoxia
•Depende de la Mitocondria.
•Se activa la apoptosis desde el interior de la célula como respuesta a un insulto
•Depende de la liberación hacia el citosol de proteínas mitocondriales que
normalmente residen en el espacio intermembranal (citocromo C)
•Involucra principalmente citocromo C/Apaf1 (apoptotic protease activating
factor1) y procaspasas 9
Trayectoria Intrínseca

Apoptosis Intrínseca. Mecanismo

Apoptosis Intrínseca. Proteínas de la superfamilia Bcl-2
• El primer miembro identiﬁcado fue la proteína antiapoptótica Bcl-2.
• Se conocen actualmente unas 20 proteínas de esta superfamilia, unas con función antiapoptótica y
otras proapoptótica.
• Todas ellas poseen al menos uno de los cuatro dominios que aparecen en Bcl-2, denominados BH1-
BH4
• De acuerdo con su estructura y función:
proteínas
antiapoptóticas
Bcl-2 y sus homólogos,
Bcl-xL y Mcl-1
proteínas
proapoptóticas
 Multidominio (Bax, Bak, Mtd)
 Proteínas “sólo-BH3”(Bim, Bad, Bid, Bik, Hrk, PUMA,
Noxa, etc.)
http://www.elsevier.es/es-revista-haematologica-49-articulo-apoptosis-mecanismos-celulares-e-implicaciones-13066671
http://diposit.ub.edu/dspace/bitstream/2445/36025/2/01.JMGM_INTRODUCCION.pdf

Proteínas de la superfamilia Bcl-2. Estructura y tipos

Proteínas Antiapoptóticas.
• Inhiben la apoptosis inducida por muchos estímulos citotóxicos y esta capacidad parece residir en
el dominio BH4
• Su dominio hidrofóbico C-terminal facilita su inserción en la membrana externa mitocondrial.
• La cavidad hidrofóbica formada por residuos de los dominios BH1, BH2 y BH3 puede interaccionar con la
hélice del dominio BH3 de una proteína “sólo-BH3”6
• Las células hematopoyéticas y tejidos linfoides suelen expresar niveles elevados de Mcl-1, que se considera un factor
importante de supervivencia en células de leucemia7 y mieloma

Proteínas Proapoptóticas multidominios
• Poseen los dominios BH1, BH2 y BH3, pero no el BH4
• En células viables, Bax es un monómero localizado preferentemente en el citosol, mientras que
Bak es una proteína de la membrana externa mitocondrial
• La inactivación simultánea de los genes de Bax y Bak, pero no la de uno de ellos, bloquea la
apoptosis

Proteínas Proapoptóticas. Sólo BH3
• Se han identificado unas 10 proteínas de esta subfamilia
• Se caracterizan por poseer sólo el dominio BH3, de 9 aminoácidos, que es necesario y suficiente para
inducir
apoptosis.
• Las proteínas “sólo-BH3” no pueden ejercer su acción apoptótica en ausencia de Bax y Bak , lo que
sugiere que su diana principal son estas proteínas

Proteínas Proapoptóticas. Sólo BH3
Existen 2 subgrupos
• De “tipo Bad” (Bad, Bik)
no se unirían a Bax y/o Bak
sino que interaccionarían e
inactivarían a las proteínas
antiapoptóticas Mcl-1, Bcl-2,
Bcl-xL.
“tipo Bid” (tBid, Bim)
podría interaccionar tanto con Mcl-1, Bcl-2
o Bcl-xL, con lo que inactivarían su acción
protectora, como con Bax y Bak,
induciendo en este último caso su
oligomerización y la formación de poros en
la membrana externa mitocondrial.

La unión de proteínas “tipo Bad” a Bcl-2/Bcl-xL/Mcl-1 liberaría a las proteínas “tipo Bid” que quedarían
disponibles para unirse a Bax/Bak, lo que causaría su oligomerización y la subsiguiente caída del potencial
mitocondrial y la liberación de citocromo c y otras proteínas apoptogénicas del espacio intermembrana
mitocondrial.
Cada una de las proteínas “sólo-BH3” estaría implicada en la transducción de señales mortales especíﬁcas y/o
en el control de la homeostasis en determinados tejidos.
Proteínas Sólo BH3. Su papel en el mecanismo de acción de A intrínseca
 Bim participa en la apoptosis inducida en linfocitos por la deprivación de citoquinas
 La actividad de Puma y Noxa es inducida por p53 por lo que parecen estar implicadas en la respuesta al daño al ADN.
 Bid participa en la apoptosis inducida por receptores mortales
 Bad y Hrk están implicados en la apoptosis inducida por deprivación de factores de crecimiento
 Bik participa en la apoptosis inducida por ligación de IgM en células B 10 .
Cory S, Huang DC, Adams JM. The Bcl-2 family: roles in cell survival and oncogenesis. Oncogene
2003;22:8590-607.
Camacho E, Hernández L, Hernández S, Tort F, Bellosillo B, Bea S, et al. ATM gene inactivation in mantle cell lymphoma mainly occurs by
truncating mutations and missense mutations involving the phosphatidyli-nositol-3 kinase domain and is associated with increasing numbers of
chromosomal imbalances. Blood 2002;99:238-44.

Características morfológicas y bioquímicas de la Apoptosis
• Formación de ampollas en la membrana pero sin pérdida de
la integridad.
• Agregación de la cromatina hacia la membrana nuclear.
• Encogimiento del citoplasma y condensación del núcleo.
• Termina con fragmentación de la célula en pequeños
cuerpos.
• Formación de vesículas rodeadas de membrana (cuerpos
apoptoticos).
• La mitocondria llega a infiltrarse debido a la formación de
poros involucrando proteínas de la familia bcl-2.
CARACTERÍSTICAS MORFOLÓGICAS CARACTERÍSTICAS BIOQUÍMICAS
• Proceso de regulación muy fuerte que involucra la activación de pasos
enzimáticos.
• Activa proceso dependiente de ATP, que normalmente no ocurren a
4°C.
• Fragmentación oligonucleosomal del DNA de forma no aleatoria.
• Fragmentación del DNA prelitica.
• Liberación de varios factores (citocromo C) de la mitocondria dentro
del citoplasma.
• Activación de la cascada de caspasas.
• Alteraciones en la asimetría de la membrana (por ejemplo la
translocación de la fosfatidilcolina de la cara citoplásmica a la cara
extracelular de la membrana plasmática).

Independiente de caspasas: Autofagia
Tipos
Macroautofagia
Autofagia mediada por chaperonas (CMA)
Microautofagia
No selectiva
(captación aleatoria de
material intracelular)
Selectiva
(captación de carga específica)
• mitofagia o autofagia selectiva de las mitocondrias (Ding y Yin 2012)
• peroxifagia (peroxisomas),
• ribofagia (ribosomas)
• Xenofagia (microbios invasores)
una pequeña porción del citoplasma es
envuelta directamente por el lisosoma

Kwanten et al. (2014)
Proceso de autofagia o macroautofagia

Kroemer et al. 2010, Mizushima y Komatso 2011; Boada-Romero et al. 2013
Los autofagosomas se generan sobre o en las proximidades del
retículo endoplasmático (ER).

Necrosis. Mecanismos
Las catepsinas son una familia de endo y
exopeptidasas localizadas principalmente en
los lisosomas, que se activan a pH ácidos
(entre 3,5 y 6,5).
Las calpaínas son proteínas
heterodiméricas, dos de las cuales son
ubícuotas (calpaína m y m) y otra con
expresión exclusiva en las células
musculares (calpaína 3 –p94). Son
enzimas citosólicas, independientes de
ATP
Las calpastatinas son los inactivadores
endógenos de las calpaínas

 Las calpaínas son una amplia familia de cisteín proteasas no lisosomales dependientes de Ca2+
 Su actividad es óptima a pH neutron, se localizan intracelularmente en el cytosol
 El Ca2+ activa a las calpaínas mediante la inducción de cambios conformacionales en la subunidad de 80kDa
La calpastatina es la única proteína conocida con acción inhibidora específica sobre las calpaínas

Substratos y funciones de la actividad de las Calpaínas
• Acción de las calpaínas en proteínas del citoesqueleto: Proteolisis de elementos del citoesqueleto
• Transducción de señales:
• Ciclo celular:

NECROSIS
↓ ATP
Disminución de oxígeno y
glucosa
↑Glucólisis anaerobia
↓pH
↑ ROS
Oxidación de lípidos
↑PLA2s
Pérdida integridad de la
membrana
↑Calcio
↑ actividad de enzimas
dependientes de Calcio
↑ Proteasas
↑ Endonucleasas
↑ATPasas
Disfunción
membranamitoc
ondrial
↑Calcio
↑ Sodio intracelular
↓ Potasio intracelular
Pérdida integridad de la
membrana celular
Daño DNA
Oxidación de proteínas
Disminución en las reservas de ATP: la vía glicolítica
inhibe el complejo III de la cadena respiratoria de la
mitocondria
favorecer la producción de ROS
necrosis
hipoxia y la anoxia acidificación
acumulación de ácido láctico
la síntesis de proteínas y
transporte de moléculas en contra del gradiente
se alteran
necrosis

Alteraciones de la bomba sodio-potasio y la movilización de calcio como mediadores de la
necrosis.
se favorece una bomba contrasentido
de Na+/H+
aumenta la concentración neta de Na+ intracelular Para restaurar el pH intracelular
alterado por la baja producción de
ATP durante la hipoxia,
se inicia la entrada de Ca y la salida de Na
sistema de transporte
contracorriente
reverso Ca2+/Na+
mecanismo de homeostasis
No regulada por bomba
ATPasa Na+/K+
aumento del calcio intracelular
↑ Proteasas
↑ Endonucleasas
↑ATPasas
necrosis

ROS
 inicia el daño de proteínas, ácidos nucleicos y lípidos
 Rompen puentes disulfuro, modificando la estructura y función de proteínas
 Promueven la apertura del poro de transición mitocondrial por medio de la oxidación del
grupo tiol del ANT (del inglés “adenine nucleotide traslocator”) y modifican los canales de Ca
asociados al retículo endoplámisco y de la membrana plasmática, aumentando su
concentración intracelular.
 Los ROS también han sido relacionados con rompimiento de la cadena de DNA

Activación de enzimas dependientes de calcio
Fosfolipasas A-2 (PLA-2).
Sustratos específicos fosfolípidos que poseen un grupo
iónico unido a un fosfato, como:
• fosfatidil colina (PC),
• fosfatidil etanolamina (PE),
• fosfatidil glicerol (PG) y
• fosfatidil serina (PS)
hidrolizan lisofosfolípido y un ácido graso
ácido araquidónico (AA)
precursor de los eicosanoides
mediadores en la inflamación
daños en la membrana celular
hay aumento de ROS y
estrés oxidativo

Características morfológicas y bioquímicas de la Necrosis
CARACTERÍSTICAS MORFOLÓGICAS CARACTERÍSTICAS BIOQUÍMICAS
• Perdida de la integridad de la membrana.
• Aumento de volumen del citoplasma y mitocondria
(oncosis).
• Termina con la lisis total de la célula.
• No hay formación de vesículas.
• Desintegración de organelos.
• Fragmentación inespecífica del DNA; entre los
patrones descritos están la picnosis nuclear o pérdida
de volumen
• Aumento de la basofilia nuclear que se designa como
cariorexis
• Cariólisis cuando ya no se detecta estructura
cromatínica.
• Perdida de la regulación de la homeostasis iónica.
• No hay requerimiento de energía.
• Digestión del DNA al azar.
• Fragmentación de DNA postlitica.

Diferencias morfológicas entre Necrosis y apoptosis

Diferencias entre Necrosis y apoptosis
Característica Apoptosis Necrosis
Estímulo Fisiológico Fisiológico Patológico
Efecto Selectivo a nivel celular Afecta tejido circundante
Reversibilidad Hasta la activación de nucleasas. Irreversible.
Activadad endonucleasas Temprana Post-mortem
Morfología celular Proyecciones digitiformes y cuerpos apoptóticos Turgencia celular
Organelas Turgencia tardía Turgencia rápida
Núcleo Cariorrexis Diversos patrones
Cromatina Condensación periférica Condensacion ligera, lisis
Fragmentación DNA Internucleosomal organizada Aleatoria.
Remoción y fagocitosis Antes de la lisis Tardía e incompleta
Inflamación Ausente, excepto piroptosis Heterolisis, Hsp
Cicatrización Ausente Fibrosis
ATP Dependiente de ATP Disminuído
Calcio Permeabilidad mitocondrial Favorece necrosis
Caspasas Dependiente Independiente

Técnicas para análisis de muerte celular
SYTO Probes: Markers of Apoptotic Cell Demise, Wlodkowic
APOPTÓSIS
Sondas SYTO
Sondas SYTO de unión a DNA
Marcadores de muerte celular apoptótica
dependientes de caspasas
Líneas celulares hematopoyéticas y muestras de
tumores primarios
Ensayos de citometría de flujo
SYTO 16 (488/518 nm) O SYTO 17 ( 621/634 nm)
excitación/emisión
+
Marcadores de permeabilidad de la membrana
(yoduro de propidio IP), necrosis

Mammalian Cell Viability: Methods and Protocols, Stoddart 2011
Diferencia:
-Apoptosis temprana
-Apoptosis tardía
-Necrosis.
Fosfatidilserinas (PS) liberadas entre la
bicapa lipídica teñidas por Anexxin V
Pierden integridad de la membrana
celular y son permeables para
colorantes vitales, 7-AAD (intercalador
de DNA)
Fosfolípido componente de la
membrana celular, usualmente
expuesto del lado del citosol
Annexin V/7-AAD
Annexin V/7-AAD
no distinguen
entre muerte
apoptótica y
necrótica

Actividad de caspasas
APOPTÓSIS
Actividad de caspasas es
inversamente proporcional
a la viabilidad celular
Unión a un gran
número de
proteínas
Reguladoras de
muerte celular
programada
tipo I (PCD),
apoptosis
Muerte
independiente
de caspas,
probablemente
necrosis
Caspasas
Zimógenos inactivos
Iniciadores
Cas8 &Cas9,
monómeros
Efectores
Cas3, Cas6 & Cas7,
dímeros, activadas
después de iniciadores
Vía apoptótica
Extrínseca
Activación por familia
de receptores de
muerte en superficie
celular. (Cas-8)
Intrínseca
Liberación de proteínas
mitocondriales asesinas
(citocromo C,
apoptosoma, Cas-9)
Inmunoblot (anticuerpos reconocen la
forma pre y activa de la enzima)
Ensayo fluorogénico con unión a
sustrato (sustratos unen a la enzima)
Tiempo de activación de caspasa a nivel
de una sola célula
Sondas que emiten fluorescencia después de la unión a caspasas
Contiene tetra (penta) péptidos que reflejan el sitio consenso para el
procesamiento de caspasas (DXXD para cas-3 y 7)
Apo-ONE® caspasa-3/7
Sondas con transferencia de tecnología de Energía de Resonancia Fluorescente
(FRET); o CFP y YFP unidas por un péptido corto que contiene sitios de unión de
consenso de caspasas diferentes
GFP unida a dominio de transmembrana mitocondrial (TM) y a sec. Consenso de
unión a caspasa (DD) → TM-DD-GFP, específico para caspsa-3/-7

Mammalian Cell Viability: Methods and Protocols, Stoddart 2011; Promega Corporation
Triplex para medir células viables, necróticas y
apoptóticas mediante ApoTox-Glo
Células
apoptóticas

Assays to Monitor Autophagy Progression in Cell Cultures; Methods for detecting autophagy and determining autophagy-induced cell death, Chen
AUTOFAGIA
Cuantificación de GFP-LC3 (proteína asociada a
microtúbulos 1 cadena ligera 3) mediante microscopía de
fluorescencia
Método empleado mayoritariamente
LC3 se encuentra en todo el citoplasma, en autofagia es
reclutada para formar las membranas de autofagosomas
Transfección de vectores CDNA con GFP o GFP-LC3
200 células fluorescentes verdes para cada muestra para
obtener un resultado estadísticamente significativo
Formación de doble membrana autofagosomas, verificación
de autofagia mediante la detección de éstos, de
autolisosomas y lisosomas, u organelos vesiculares ácidos

Methods for detecting autophagy and determining autophagy-induced cell death, Chen
AUTOFAGIA
Cuantificación de organelos vesiculares ácidos (AVO) por
citometría de flujo
Detección de autolisosomas (AVO)
Mediante colorante sensible a pH naranja de acridina (AO)
AO, colorante fluorescente permeable a las células que tiñe
el ADN y el citoplasma verde brillante
Puede entrar a compartimientos ácidos (lisosomas o
autolisosomas) donde se protona
A bajo pH emite un rojo fluorescente proporcional al grado
de acidez
Medición por citometría de flujo o FACS, y observado al mc

Western blotting de Atg8/LC3 (conversión de
LC3-I a LC3-II)
AUTOFAGIA
Durante la autofagia la forma citosólica de LC3 (LC3-I,
19kDa) se transloca a membranas de los autofagosomas
LC3-II (16 kDa) se puede separar de la forma LC3-I en SDS-
PAGE
La formación de autofagosomas se puede medir por la
conversión de LC3-I a LC3-II por Western blot

Classification of cell death: -recommendations of the Nomenclature Committee on Cell Death, Kroemer G., et al., 2009
APOPTOSIS
CARACTERÍSTICAS QUÍMICAS MÉTODOS DE DETECCIÓN
Activación de la familia de proteínas
proapoptóticas Bcl-2 (Bax, Bak, Bid)
Estudios de localización microscópica por IF, inmunoblot con anticuederpos de
conformación específica
Activación de caspasas
-Ensayos colorimétricos/fluorogénicos basados en sustratos de en células vivas y
de lisados de microplacas
-FACS/cuantificación con microscopia de IF con anticuerpos específicos a sitios
activos de caspasas, unión de sustratos a caspasas, y con sustratos fluorogénicos
-Evaluación mediante inmunoblot de activación de caspasas por sitios activos, y
unión a productos de caspasas.
Disipación ΔΨm (Permeabilización de la
transmembrana mitocondrial)
Técnica de calceína-cobalto (FACS/microscopía de IF)
FACS/cuantificación microscopía de IF con sondas sensibles a ΔΨm
Estudios de consumo de O2 (polarografía)
MMP (Permeabilización de la membrana
mitocondrial)
-Técnicas colorimétricas para evaluar la accesibilidad de sustratos exógenos de im-
incurstados a actividades enzimáticas
-Detección asistida por FACS de proteínas IMS sobre la permeabilización de la
membrana plasmática, y de parámetros físicos de mitocondrias purificadas
-Cuantificación asistida por HPLC de alteraciones mitocondriales
-Estudios de colocalización mediante microscopia de IF de proteínas IMS (Cyt c)
con proteínas mitocondriales sésiles (VDAC1)
- Detección mediante Inmunoblot de proteínas IMS (Cyt C) sobre fraccionamiento
celular
APOPTOSIS
Fragmentación oligonucleosomal de DNA
DNA Ladder, Cuantificación a través de FACS en células hipodiploides; ensayo
TUNEL
Ruptura de membrana plasmática
-Ensayos colorimétricos / fluorogénicos basados en sustrato de sobrenadantes de
microplacas para determinar liberación de actividades enzimáticas citosólicas
-Cuantificación por FACS con tintes vitales
Exposición de fosfatidilserina Cuantificación por FACS a través e la unión Annexin V
Sobreproducción de ROS (Especies Reactivas
de Oxígeno)
Cuantificación por FACS/microscopia IF con sondas sensibles a ROS
Acumulación de ssDNA Cuantificación por FACS con anticuerpos específicos de ssDna
NECROSIS
Activación de calpainas
Ensayos colorimétricos/fluorogénicos basados en sustratos de lisados de células
en microplacas
Activación de catepsinas
Ensayos colorimétricos/fluorogénicos basados en sustratos células vivas, y de
lisados de células en microplacas
Disminución de los niveles de ATP Evaluaciones luminométricas de niveles de ATP/ADP
Liberación de HMGB-1 Inmunoblot de medio de cultivo con anticuerpos específicos a HMGB-1
Permeabilización de la membrana lisosomal Cuantificación con sondas lisomorfotropicas
Ruptura de membrana plasmática
Ensayos colorimétricos/fluorogénicos basados en sustratos de sobrenadante de
cultivos en microplacas para determinar la liberación de actividades enzimáticas
citolítocas
NECROSIS
Fosforilación RIP1 Inmunoblot con anticuerpos específicos a fosfato neoepítope
Ubiquitinización de RIP1
Inmunoprecipitación con anticuerpos anti-RIP1 seguidos de
inmunoblot con anticuerpos anti-ubiquitina
Sobreproducción de ROS Cuantificación de FACS con pruebas sensibles ROS
Patrón de unión específico a PARP1 Inmunoblot con anticuerpos específicos a PARP1
AUTOFAGIA
Disociación Beclin-1 de Bcl-2/XL Estudios de co-inmunoprecipitación
Dependencia de los productos del
gen atg
Estudios genéticos (modelos de knockout, iRNA, sistemas de
sobreexpresión a través de plásmidos)
Conversíón de LC3-I a LC3-II Microscopia de IF con fusión de proteínas GFP-LS3
Degradación de 𝑝62𝐿𝑐𝑘 Inmunoblot con anticuerpos específicos a p62
CORNIFICACIÓN
Expresión de TGs
(Transglutiminasa)
Inmunoblot de anticuerpos específicos a TG de tipo 1, 3, y 5 por
qRT-PCR
Expresión de sutratos de TGs
Inmunoblot con anticuerpos específicos a sustratos de TGs
(loricrina, SPR…) por qRT-PCR
Actividad cruzada Detección mediante de HPLC de uniones de isopéptidos K-L

Biomarcadores intrínsecos y extrínsecos
Biomarkers and Molecular Probes for Cell Death Imaging and Targeted Therapeutics, Smith B., & Smith B.,

Marcadores apoptóticos y necróticos
Measurement of Cell Death in Mammalian Cells, Cummings B., et al., 2004

A quantitative real-time approach for discriminating apoptosis and necrosis, Lekshmi A., et al., 2017
El método utiliza células cancerosas que
expresan de manera estable la sonda de
detección de caspasa activa basada en FRET
genéticamente codificada y la proteína
fluorescente DsRed dirigida a la mitocondria.
La activación de caspasa es visualizada por la
pérdida de FRET tras la unión de la sonda;
mientras que la retención de fluorescencia
mitocondrial y la pérdida de la sonda FRET
antes de su unión confirma la necrosis.
La ausencia de la unión y la fluoresencia de la
mitocondrial denota las células vivas.

SYTO Probes: Markers of Apoptotic Cell Demise, Wlodkowic
APOPTOSIS
Sondas SYTO
Sondas SYTO de unión a DNA
Marcadores de muerte celular apoptótica
dependientes de caspasas
Líneas celulares hematopoyéticas y muestras de
tumores primarios
Ensayos de citometría de flujo
SYTO 16 (488/518 nm) O SYTO 17 ( 621/634 nm)
excitación/emisión
+
Marcadores de permeabilidad de la membrana
(yoduro de propidio IP), necrosis

Human Apoptosis Array G1 (AAH-APO-G1)
RayBio®
Detects 43 Human Apoptotic Factors

Human Apoptosis Signaling Array C1
Detects 19 phosphorylated or cleaved human Apoptotic
Factors

Human Apoptosis RT² Profiler PCR Array
QIAGEN®
Expresión de 84 genes
claves involucrados en la
muerte celular programada

Controles positivos
Staurosporina
Inhibidor de
proteincinasa que
induce la
apoptósis
Control positivo
en ensayos de
apoptósis
Ionomicina
Ionóforo de calcio
Inductor de
apoptosis a través
de la activación
de calpaina
Clorhidrato de
doxorrubicina
Inhibidor de la
Topoisomerasa II
Previene la
síntesis de ac.
nucleicos, induce
apoptósis
Paclitaxel
Agente
anticancerígeno,
Inhibe
despolimerizació
n de los
microtúbulos
Provoca arresto
mitótico en
células
cancerosas y
apoptósis
siRNAs
Controles de
muertes celular,
con blancos a
genes esenciales
Transfección
siRNA y visible
muerte celular en
microscopio
Potencial de
membrana
mitocondrial
FCCP,
desacoplador de
ionóforo de la
fosforilación
oxidativa
Eliminación del
potencial de
membrana
Necrosis
Calor
Solución de lísis
(X-100Triton)
Cell Viability and Cell Death, Biotium; abcam®; Promega; QIAGEN; Apoptosis, abcam®

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