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1. Hidrocoloides alimentarios 93 (2019) 226–234
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Hidrocoloides alimentarios
revista Página de inicio: www.elsevier.com/locate/foodhyd
Investigación mecanicista a través de QCM-D sobre la estabilidad del color impartida a las
betacianinas por la presencia de polisacáridos aniónicos de calidad alimentaria
Meghan Marchuka, Michael J. Seliga, Giovana B. Cellia, Peter Lawrencea, Detlef-M. EmoticonosB,C,
Alireza Abbaspourrada,∗
a Departamento de Ciencias de los Alimentos, Universidad de Cornell, Ithaca, NY, 14853, EE. UU.
B Fuente de sincrotrón de alta energía de Cornell (CHESS), Universidad de Cornell, Ithaca, NY, 14853, EE. UU.
C Escuela de Ingeniería Química y Biomolecular RF Smith, Ithaca, NY, 14853, EE. UU.
INFORMACIÓN DEL ARTÍCULO ABSTRACTO
Palabras clave:
Extracto de remolacha
Betacianina
Estabilidad de color
Polisacárido aniónico
Vinculante
QCM-D
La capacidad conocida de polisacáridos aniónicos selectos (goma arábiga, pectina de remolacha, goma de xantano y alginato
de sodio) para mejorar la estabilidad del color térmico y en almacenamiento de las betalaínas de remolacha a una acidez de
bebida suave (pH 5) y típica (pH 3,2) se destaca y estudia aquí. . Los mecanismos que imparten estabilidad se investigan
mediante medidas de tamaño de partícula en solución, potencial zeta y autofluorescencia junto con estudios de unión de
microbalanza de cristal de cuarzo con disipación (QCM-D). El alginato de sodio y la goma de xantano conservan mejor los
tonos rojos en soluciones acuosas mediante almacenamiento acelerado (40 ° C) a ambos pH. Sin embargo, mientras que los
complejos de alginato mejoraron la estabilidad térmica a pH 3,2, las mezclas de goma de xantano y pigmento tenían los
polisacáridos más pobres a 55 ° C. La pectina de remolacha mostró efectos estabilizadores solo a pH 5,0. Los potenciales zeta
altamente negativos de las mezclas de pigmentos de alginato y xantano a pH y mezclas de pectina de remolacha a pH 5,0
sugieren que un entorno de carga negativa creado por sustituyentes polisacáridos de ácido urónico puede ayudar a la
estabilización del color. Los datos de tamaño de partícula sugieren además que el alginato de sodio forma complejos solubles
con extractos de remolacha. QCM-D mostró que la betacianina purificada se une de manera irreversible y más significativa a
las superficies recubiertas con los polisacáridos más negativos y lineales, alginato o goma de xantano. La unión del pigmento
a polisacáridos fuertemente ramificados (goma arábiga y pectina de remolacha) no fue significativa y fue reversible. Además,
los cambios de disipación representados frente al cambio de frecuencia sugieren que la unión de la betacianina al alginato y
la goma de xantano es más rígida a pH 3,2 que a pH 5,0.
1. Introducción Mejorar la estabilidad de estas fuentes de color es una prioridad para las
empresas que buscan mantener el atractivo y la integridad de sus productos a
medida que avanzan hacia el uso de ingredientes naturales (Francis, 1995).
Las betalaínas son una clase de pigmentos heterocíclicos nitrogenados que incluyen
betaxantinas amarillas y betacianinas rojas (Figura 1). Las betacianinas han ganado
popularidad recientemente como colorantes rojos naturales debido a su alta fuerza
tintórea y solubilidad en agua (Stintzing y Carle, 2007). A diferencia de las antocianinas,
las betacianinas exhiben una alta estabilidad tanto en productos alimenticios neutros
como de baja acidez (Stintzing y Carle, 2004). Aunque las betalaínas ofrecen una
alternativa mejorada bajo ciertas condiciones de pH, tanto las betacianinas rojas como
los compuestos de pigmentos de betaxantina amarilla son innatamente sensibles al pH
bajo (<4.0), la luz, el oxígeno, los iones metálicos, la alta actividad del agua y la
temperatura (Herbach, Stintzing y Carle, 2006). La alta susceptibilidad de las betalaínas a
la degradación durante el procesamiento y las condiciones de almacenamiento
prolongadas ha creado una gran barrera para su uso en la industria alimentaria. Hay un
puñado de fuentes de betalaína.
En los últimos años, la percepción negativa de los consumidores sobre el uso
de colorantes sintéticos como el rojo 40 en productos alimenticios ha llevado a la
industria alimentaria a buscar alternativas más naturales. En particular, los
pigmentos rojos naturales betalaínas de la remolacha y las antocianinas de las
bayas y tubérculos se han utilizado como sustitutos del color rojo sintético en
productos alimenticios; los ejemplos incluyen productos lácteos fríos como yogur
y helado (Aberoumand, 2011; Pasch, Von Elbe y Sell, 1975;Wallace y Giusti, 2008),
golosinas y mermeladas (Falcão et al., 2009; Roy, Gullapalli, Roy Chaudhuri y
Chakraborty, 2004), e incluso carnes (Agrawal, 2013). Aunque estos pigmentos
naturales ofrecen una mejor aceptación por parte del consumidor, su
inestabilidad inherente en las condiciones de procesamiento y almacenamiento a
largo plazo es un problema importante para los fabricantes de alimentos. Dado
que el color de los productos alimenticios es un predictor importante de la calidad
y la palatabilidad del consumidor, se reduce la degradación y
∗ Autor correspondiente.
Dirección de correo electrónico: Alireza@cornell.edu (A. Abbaspourrad).
https://doi.org/10.1016/j.foodhyd.2019.01.057
Recibido el 14 de junio de 2018; Recibido en forma revisada el 13 de diciembre de 2018; Aceptado el 26 de enero de 2019
On-line el 08 de febrero de 2019
0268-005X / © 2019 Elsevier Ltd. Todos los derechos reservados.
Traducido del inglés al español - www.onlinedoctranslator.com

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Figura 1. Moléculas de pigmento de betalaína: estructura de betacianina roja (izquierda), estructura de betaxantina amarilla (centro) y betanina, la principal betacianina en el pigmento de remolacha
(derecha). (Para interpretar las referencias al color en la leyenda de esta figura, se remite al lector a la versión web de este artículo).
disponible para los fabricantes, aunque actualmente el polvo de raíz de remolacha
es el único aprobado por la FDA de EE. UU.: https://www.fda.gov/ForIndustry/
ColorAdditives / ColorAdditiveInventories / ucm106626.htm.
En consecuencia, los mecanismos de degradación de la betanina, la principal
fuente de pigmento rojo en la remolacha, se han estudiado ampliamente en
diferentes condiciones de procesamiento y almacenamiento. Bajo procesamiento
térmico, la betanina se degrada en ácido betalaámico y ciclo-Dopa 5-O-glucósido
para producir un color amarillo desfavorable (Herbach et al., 2006). De acuerdo a
Schwartz y Von Elbe (1983) esto se debe a la ruptura hidrolítica del enlace
aldimina. El desarrollo de ácido betalaámico como indicador de degradación se
puede controlar fácilmente evaluando los cambios máximos en los espectros
visibles de betanina a 535 nm y ácido betalaámico a 430 nm (Saguy, Kopelman y
Mizrahi, 1978). Otros tipos de vías de degradación observadas para la betanina
incluyen descarboxilación, desglicosilación y deshidrogenación. La betanina
también puede isomerizarse en isobetanina, que sigue vías de degradación
similares y puede descomponerse en neobetanina amarilla con un tratamiento
térmico aeróbico (Herbach, Stintzing y Carle, 2004, 2006).
Los métodos de almacenamiento destinados a la estabilización de betalaínas
se han centrado en minimizar la exposición al calor, la luz, el oxígeno y el agua.
Los estudios han demostrado que la estabilidad de la betacianina se puede
mantener durante más tiempo al vacío o si se blanquea y luego se mantiene en
ausencia de luz (Jackman y Smith, 1996; Ravichandran et al., 2013). Si bien estos
métodos son simples y efectivos, en última instancia son soluciones poco prácticas
para los fabricantes de alimentos que utilizan envases transparentes de usos
múltiples o tienen requisitos específicos de procesamiento térmico. La inclusión de
aditivos alimentarios, como antioxidantes y agentes quelantes, parece ser una
solución más realista para muchos productos alimenticios. Como ejemplo,
estudios previos han demostrado que la adición de ácido ascórbico o pequeñas
cantidades de EDTA podría preservar la fuerza tintórea de los pigmentos de
remolacha roja (Reynoso, García, Morales y Mejía, 1997; Woo, Ngou, Ngo, Soong y
Tang, 2011). Además, la encapsulación de betalaínas con ciertos polisacáridos ha
mostrado efectos estabilizadores sobre los pigmentos atribuidos a niveles más
bajos de actividad del agua dentro del complejo de carbohidratos (Azeredo,
Santos, Souza, Mendes y Andrade, 2007; Pitalua, Jimenez, Vernon-Carter y
Beristain, 2010; Savolainen y Kuusi, 1978). Recientemente, nuestro grupo ha
demostrado que el procesamiento a alta presión (HPP) aumenta la estabilidad de
los complejos de remolacha-carbohidrato en condiciones ácidas (Selig y col., 2018).
Si bien se han realizado avances para mejorar la estabilidad de los pigmentos de la
remolacha utilizando hidrocoloides comunes, aún se necesitan investigaciones
que descubran los mecanismos que imparten estabilidad.
El presente estudio intenta proporcionar información sobre los mecanismos
de estabilización impartidos por los carbohidratos aniónicos en las betacianinas.
Aquí, se destacan las leves mejoras a la estabilidad térmica y en almacenamiento
impartidas por la complejación con pectina de remolacha, goma xantana, goma
arábiga y alginato de sodio. Los complejos con carbohidratos se evaluaron
visualmente para determinar el grado de retención de color.
Los estudios de asociación / unión entre betacianinas purificadas y los
polisacáridos aniónicos se llevan a cabo mediante el uso de microbalanzas de
cristal de cuarzo con técnicas de control de disipación (QCM-D). Las interacciones
informadas en este último son informativas y pueden llevar a los investigadores
interesados en la estabilización de betalaína a estrategias nuevas y mejoradas.
2. Materiales y métodos
2.1. Materiales
El polvo de remolacha se adquirió en Bulk Supplements (Henderson, NV, EE.
UU.). La pectina de remolacha (BP) fue proporcionada amablemente por CP Kelco
(Chicago, IL, EE. UU.) Como Genu® Pectina BETA. TIC Prested® El polvo seco por
pulverización de goma arábiga (GA) fue proporcionado por TIC Gums (White
Marsh, MD, EE. UU.). La goma xantana (XG) utilizada en este estudio (tipo C) fue
proporcionada como muestra por Colony Gums (Monroe, NC, EE. UU.) Y el alginato
de sodio (Manugel GHB; Alg) fue proporcionado por FMC Biopolymer (Filadelfia,
PA, EE. UU.) . Se utilizó ácido cítrico de grado alimenticio para la preparación de
todas las soluciones tamponadas y todos los demás productos químicos utilizados
fueron de grado reactivo. Para la espectrometría de masas, todos los reactivos
eran de calidad HPLC de Sigma Aldrich (St. Louis, MO, EE. UU.).
2.2. Estudios de estabilidad del complejo pigmento-polisacárido
Se observó la estabilidad en almacenamiento de cuatro complejos de betalaína-
carbohidrato en agua durante un período de 2 semanas en microplacas de poliestireno
de 24 pocillos a temperatura ambiente (20 ° C). También se llevó a cabo una prueba
acelerada de estabilidad en almacenamiento de manera similar en tampón de citrato de
sodio 10 mM a pH 3,2 y 5. Brevemente, se mezclaron bien soluciones acuosas al 1% de
polvo de remolacha mediante agitación manual e inversión para permitir una hidratación
completa, centrifugadas a 3000 rpm durante 10 min, y la solución de pigmento se
decantó y se utilizó para la prueba. Se prepararon cinco soluciones madre para su
evaluación, incluida una muestra de control de la solución en polvo de remolacha (Bt-
Ext). A continuación, se añadieron componentes de carbohidratos individuales (BP, XG,
GA, Alg) a una concentración del 1% (p / p). Todas las soluciones, incluido un control sin
polisacáridos, se diluyeron 1 en 2 en tampón de citrato de sodio 10 mM a pH 3,2 o 5. El
cambio en la absorbancia de las soluciones se comparó a lo largo del tiempo utilizando
un lector de microplacas multimodo SpectraMax iD3 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA,
EE. UU.). Se utilizaron fotografías para mostrar cualitativamente la suave estabilidad del
color impartida a las soluciones de remolacha a lo largo del tiempo.
Estudio adicional de estabilidad térmica de las soluciones preparadas a pH
3.2 y 5 a 55 ° C se llevaron a cabo durante un período de 6 h en pocillos llenos de
microplacas de 96 pocillos incubados dentro del lector de placas; mediciones de
absorbancia cada 5 min de 400 a 700 nm en incrementos de 5 nm; el período de
tiempo se limitó a 6 h en este caso para asegurarse de evitar cualquier
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pérdida significativa por evaporación de los pozos. Los resultados de estas
pruebas se presentaron como porcentajes promedio de la absorbancia inicial a
530 nm menos la absorbancia a 650 nm (blanco interno).
para cada analito al área total de la EM1 exploraciones. Las muestras se analizaron
utilizando una trampa de iones lineal Thermo LTQ con una fuente de ESI y una
HPLC Aglient 1100 en el extremo frontal (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA,
EE. UU.). Las muestras se separaron utilizando una columna Phenomenex Luna 3
μm PFP 100 (100 mm x 4,6 mm) a temperatura ambiente. Las fases móviles
consistieron en A) 2% de ácido fórmico en agua y B) 100% de acetonitrilo, y se
utilizó el siguiente gradiente corrido a un caudal constante de 0,6 mL / min: 0
min-95% A, 35 min-80% A, para un tiempo de ejecución total de 35 min. SRA2 Se
registraron escaneos de vulgaxantina I, vulgaxantina II y betanina para
determinar los mejores iones de transición para escanear en modo SRM. Las
transiciones utilizadas fueron 381> 279, 382> 279 y 550> 389, nm respectivamente.
Todas las exploraciones SRM se obtuvieron utilizando una energía de colisión de
15.0 keV y una ventana de masa de 3.0 unidades de masa en modo de iones
positivos. Las áreas de los picos de muestra se calcularon utilizando el software
Thermo Excalibur.
2.3. Colorimetria
Se utilizó el espacio de color 1976 CIE L *, a * yb * para evaluar el color y los cambios
de color en las soluciones de pigmento durante los estudios de estabilidad en
almacenamiento acelerados. Los valores L * (luminosidad), a * (eje rojo-verde) yb * (eje
azul-amarillo) se recolectaron usando un colorímetro portátil Konica Minolta Chroma
Meter CR-400/410 (Osaka, Japón) escaneando el extracto de remolacha soluciones
directamente sobre los pocillos de las microplacas de 24 pocillos. Cambios de color (ΔE *
ab) se evaluaron a partir de estos valores antes (subíndice 1) y después (subíndice 2) del
período de almacenamiento y se calcularon de acuerdo con
la siguiente ecuación:
miab = (L2 - L1)2 + (a2 - a1)2 + (B2 - B1)2 (1) 2.8. Espectroscopía infrarroja de reflectancia total atenuada-transformada de Fourier
(ATR-FTIR)
Todos los datos de color representan promedios de escaneos de pruebas de estabilidad de
color por triplicado en cada condición.
Los espectros FTIR del pigmento liofilizado extraído del polvo de remolacha y
las fracciones posteriores asociadas con el proceso de purificación se tomaron en
un espectrómetro IRAffinity-1S equipado con un accesorio ATR de reflexión única
(Shimadzu Corporation; Kyoto, Japón). Todos los espectros fueron promedios de
32 escaneos de 500 a 4000 cm−1 con una resolución de 4 cm−1. Los datos
presentados son espectros únicos representativos de lecturas por triplicado y se
presentan como la variante normal estándar de cada conjunto de datos, de
acuerdo conBarnes, Dhanoa y Lister (1989).
2.4. Medidas de tamaño y potencial zeta
Las soluciones que contenían polvo de remolacha acuosa al 1% (p / p)
con o sin polisacáridos se diluyeron 10 veces con citrato de sodio 0,01 M a
pH 3,2 o 5 antes de medir el tamaño y el potencial zeta. La carga superficial y
el tamaño de los complejos se evaluaron usando un medidor zeta NanoZS90
(Malvern Instrument Ltd., Worcestershire, Reino Unido) a 25 ° C con un
ángulo de dispersión fijo de 90 °. Todas las muestras se analizaron por
triplicado y los datos se presentaron como promedios de estas réplicas.
2.9. Prueba de fluorescencia intrínseca
Se observó fluorescencia intrínseca de los extractos de remolacha purificados
y en bruto solos y en combinación con los polisacáridos probados usando un
Spectro Fluorophotometer RF-6000 (Shimadzu, Kyoto, Japón). Se prepararon
soluciones de muestra a pH 5,0 en tampón citrato a concentraciones de remolacha
o polisacáridos de 0,1% (p / p) y se cargaron en cubetas de cuarzo de 1 cm. Se
recopilaron espectros de excitación-emisión completos de 250 a 700 nm con
incrementos de 5 nm en todos los escenarios para evaluar completamente los
cambios en la fluorescencia intrínseca impartida por el polisacárido, aunque aquí
solo se presentaron los espectros de emisión relevantes a una longitud de onda
de excitación de 290 nm.
2.5. Purificación de betacianina a partir de extracto de remolacha.
Se preparó una solución al 10% (p / p) de polvo de remolacha en tampón de
citrato de sodio 10 mM a pH 3,2 y 5. Las soluciones se mezclaron bien, se
centrifugaron a 3000 rpm durante 10 min y se decantaron. Los sobrenadantes se
purificaron en lotes de 10 ml utilizando una columna llena de resina de
intercambio aniónico Q-Sepharose Fast Flow (GE Healthcare) en un FPLC Bio-Rad
BioLogic LP (Bio-Rad; Hercules, CA) equipado con un modelo Bio-Rad. Colector de
fracciones 2110. Se usó un tampón de citrato de sodio 10 mM a pH 5 como fase
móvil A. Después de que una fracción roja inicial salió de la columna, se introdujo
un gradiente del 20% de tampón de citrato de sodio 10 mM a pH 5 con NaCl 1 M
como fase móvil B. Después de que se recogieron las segundas fracciones rojo /
rosa deseadas, se aumentó la proporción de fase móvil B al 100% para recoger las
fracciones restantes de la columna. Las fracciones de rojo / rosa deseadas se
procesaron luego en una columna de exclusión por tamaño usando Bio-Gel P-2
Gel (Bio-Rad Laboratories, CA) con el propósito de intercambio de tampón y la
eliminación de componentes residuales de gran peso molecular; la fase móvil era
tampón de citrato de sodio 10 mM a pH 3,2 o 5; Se recogieron lotes a ambos pH
para estudios de unión.
2.10. Microbalanza de cristal de cuarzo con monitorización de disipación (QCM-D)
Se utilizó la microbalanza de cristal de cuarzo con monitorización de
disipación (QCM-D) para evaluar la asociación de la betacianina
purificada con polisacáridos aniónicos seleccionados a pH 3,2 y 5.
Todas las pruebas de QCM-D se llevaron a cabo en un sistema de
módulo único Q-Sense Explorer de Biolin Scientific (Gotemburgo,
Suecia) con SiO recubierto de oro2 sensores de base (QSX 301). Se
prepararon capas de polisacárido base en los sensores de oro desnudo
haciendo fluir soluciones al 0,1% (p / p) en tampón de citrato (pH 3,2 o
5) de XG, BP, GA o Alg a través del módulo QCM-D a un flujo de 0,1 mL /
min. Después de la formación de una capa de polisacárido estable y el
lavado con tampón limpio, se pasaron soluciones tamponadas de
betacianina purificada sobre los sensores revestidos al mismo caudal.
Este procedimiento se repitió por triplicado a cada pH para cada tipo de
polisacárido aniónico. Los datos presentados son cambios de
frecuencia y disipación de la frecuencia de resonancia del séptimo
armónico de los sensores con revestimiento de oro base y son
conjuntos de datos individuales representativos de los análisis por
triplicado.Sauerbrey (1959).
Todas las ejecuciones experimentales replicadas arrojaron resultados reproducibles
en sensores limpiados de acuerdo con el siguiente protocolo: los sensores se sonicaron
con etanol al 50% en un baño de agua a 60 ° C durante 10 minutos, se enjuagaron con
agua desionizada y luego se sonicaron en peróxido de hidrógeno al 6% a
2.6. Espectroscopia de luz visible
Los espectros de absorción de luz visible del extracto de remolacha y las
fracciones purificadas se obtuvieron utilizando el lector de placas UV-Vis descrito
anteriormente. Inicialmente, todas las soluciones se liofilizaron utilizando un
Freezedryer FreeZone 2L Benchtop Freezedryer (Labconco; Kansas City, MO).
Luego, se disolvieron 2 mg de cada polvo en 1 mL de agua desionizada y se
pipetearon 200 μL de cada solución por triplicado en una placa de 96 pocillos.
2.7. Espectrometría de masas
Las concentraciones de vulgaxantina I, vulgaxantina II y betanina en comparación
con los niveles totales de señal de la muestra se determinaron comparando el área bajo
la curva de las exploraciones de monitoreo de reacción (SRM) seleccionadas
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60 ° C durante 30 min. Después de esto, se descartó la solución de peróxido y los
sensores se enjuagaron con agua desionizada y se sonicaron en agua desionizada a 60 °
C durante 30 min. Finalmente, los sensores se enjuagaron minuciosamente con agua
desionizada limpia antes de volver a usarlos.
tabla 1
Valores de ΔE * ab y porcentaje de color rojo retenido (% a * retenido) utilizando datos de color CIE L * a * b
* de pruebas de estabilidad en almacenamiento aceleradas a 40 ° C después de 24 h.
Muestra ΔE∗
ab % a * retenido
pH 3,2 pH 5,0 pH 3,2 pH 5,0
2.11. Análisis estadístico
Bt-Ex
Bt-Ex + BP
Bt-Ex + Alg
Bt-Ext + GA
Bt-Ext + XG
11,4 ± 2,3
12,2 ± 2,5
8,5 ± 3,5
13,1 ± 1,9
12,5 ± 1,5
15,3 ± 3,4
7,3 ± 2,0 *
6,5 ± 0,8 *
14,2 ± 4,0
3,0 ± 0,1 *
69,0 ± 3,0
58,5 ± 7,9
78,6 ± 6,6 *
69,3 ± 2,5
135,7 ± 34,8 *
64,3 ± 5,0
76,6 ± 3,0 *
76,6 ± 5,1 *
55,4 ± 10,3
102,3 ± 4,0 *
Los perfiles de disipación y frecuencia de QCM-D, los espectros UV-Vis y los espectros
ATR-IR proporcionados en este manuscrito son conjuntos de datos individuales
representativos de ejecuciones por triplicado en cada condición. Todos los demás
conjuntos se presentan como promedios de ejecuciones por triplicado en cada escenario
y las barras de error representan desviaciones estándar. Cuando fue relevante, la
significancia estadística entre medias se determinó mediante análisis de varianza
unidireccional (ANOVA) con la prueba post-hoc de Tukey conp < 0,05.
Abreviaturas: extracto de remolacha (Bt-Ext); pectina de remolacha (BP); alginato de
sodio (Alg); goma arábiga (GA); goma de xantano (XG); * indica significancia entre valores
y control Bt-Ext.
Las pruebas de almacenamiento acelerado a pH ácidos y una temperatura
elevada de 40 ° C mostraron que tanto Alg como XG tenían el efecto más
estabilizador del color rojo original del pigmento, particularmente a pH 3.2,
mientras que BP fue más efectivo a pH 5, y GA mostró poca estabilidad notable
3. Resultados y debate
El objetivo de este estudio fue conocer los mecanismos que pueden permitir
mejoras leves a moderadas en el estante y la estabilidad térmica del color rojo que
presentan los pigmentos extraídos de remolacha en presencia de polisacáridos
aniónicos seleccionados. Este trabajo destaca el potencial de almacenamiento
mejorado y la estabilidad térmica impartida a las soluciones acuosas de Bt-Ext
tamponadas con citrato de sodio por la presencia del ácido urónico seleccionado
que contiene polisacáridos, GA, BP, XG y Alg. Estas observaciones luego se
relacionan con los potenciales zeta y los tamaños de partícula promedio medidos
en las soluciones de pigmento-polisacárido, y luego se correlacionan aún más con
los estudios de QCM-D que comparan las interacciones asociativas entre los
polisacáridos seleccionados y las betacianinas purificadas de Bt-Ext.
Las pruebas iniciales cualitativas de estabilidad en almacenamiento de los
complejos Bt-Ext-carbohidrato a temperatura ambiente en agua indican cierto
grado de estabilización del color rojo por los polisacáridos aniónicos. La
estabilidad impartida fue mayor para Alg, en el siguiente orden: Alg> XG> BP> GA (
Figura 2). Después de dos semanas, los controles Bt-Ext se degradaron de un tono
rojo vibrante a un tono amarillo-marrón; la adición de GA produjo una solución
amarilla; la inclusión de BP o XG proporcionó una preservación moderada de las
betacianinas rojas, lo que dio como resultado tonos redondos; y la adición de Alg
demostró ser superior para preservar el tono rojo de las betacianinas presentes
en esta condición. Esto está en línea con estudios previos que muestran que la
encapsulación de betalaínas en matrices Alg ofrece una mejor retención del color
rojo durante el almacenamiento (Otálora, Carriazo, Iturriaga, Osorio y Nazareno,
2016; Rodríguez-Sánchez, Cuatzo-Lozano, Pérez-Loredo, Abarca-Sarro y Navarro,
2017).
mejora a pH 3,2 (Figura 2). Valores de cambio de color (Δmi∗ ab) y el
los cambios de color rojo asociados (Δa *) derivados de los datos del espacio de color CIE
L * a * b * para estas pruebas se presentan en tabla 1. En términos de preservación del
color rojo específicamente (valores a *), los valores ponderados entabla 1muestran que
Alg y XG se estabilizaron más en ambas condiciones ácidas, mientras que BP también fue
eficaz a pH 5. Además, los valores a * de las muestras de XG aumentaron algo durante el
período de almacenamiento, lo que podría sugerir en este caso que el XG o los
componentes del XG, puede desempeñar un papel de co-pigmentación potenciador del
color.
Las muestras también se sometieron a temperaturas más altas, 55 ° C, y se
registró la absorbancia visible a lo largo del tiempo hasta 6 h; los resultados se
muestran enFig. 3. La disminución en las señales de absorbancia asociadas con
betaxantinas (amarillo; 480 nm) y betacianinas (rojo; 530 nm) fue la menos
significativa en presencia de Alg a pH 3.2 y BP a pH 5. A esta temperatura, Alg
también fue el segundo más estabilizándose a pH 5. Curiosamente, XG no
impartió estabilidad de color y puede haber acelerado la tasa de pérdida de color
en ambos pH. La estabilidad térmica mejorada de las betalaínas de remolacha con
la adición de Alg al pH más bajo está corroborada por nuestro estudio anterior de
alta presión que indicó que los complejos Bt-Ext-Alg mejoraron levemente la
estabilidad térmica antes del tratamiento de alta presión (Selig y col., 2018).
También especulamos aquí que la pérdida del potencial estabilizador del color de
XG a temperaturas más altas puede deberse a cambios conformacionales que se
sabe que ocurren en este polisacárido específico a temperaturas más altas (
Holzwarth, 1976).
Las mediciones de potencial zeta mostradas en Figura 4 proporcionan una idea de
los mecanismos que imparten la estabilidad del color de la betalaína. Más notablemente,
la inclusión de Alg o XG tanto en condiciones de pH como en BP a pH 5 resultó en los
potenciales zeta más negativos medidos en solución. Es posible que la capacidad de
estos polisacáridos para estabilizar las betalaínas esté relacionada con la mayor densidad
de carga negativa que presentan. En este contexto, cabe señalar el drástico aumento del
potencial zeta negativo de BP a medida que el pH se eleva de 3,2 a 5, siendo este último
BP un estabilizador de color eficaz. Además, las medidas de dispersión de luz para
evaluar el tamaño medio de partícula en las soluciones estudiadas (Figura 5) indican que
el Alg y los componentes solubles (betalaínas) de los extractos de remolacha
probablemente forman complejos solubles que son más grandes que los tamaños de
partícula medidos para el Bt-Ext y el Alg solo; este no es el caso de los otros polisacáridos.
Dado que el Alg probado muestra la mejor y más amplia estabilidad de color frente a las
betalaínas de remolacha, estos datos sugieren que la asociación de pigmento-
polisacárido que da como resultado la formación de complejos estables puede ser
beneficiosa. Un estudio sobre las propiedades del alginato mencionó que a pH bajo, las
interacciones hidrostáticas intramoleculares del alginato se debilitan y los enlaces
intermoleculares y las fuerzas de entrelazamiento comienzan a dominar (Bu, Kjøniksen y
Nyström, 2005). La tendencia a formar enlaces intermoleculares en combinación con la
carga superficial notablemente alta y los datos de tamaño de partícula pueden explicar
por qué el alginato tiene un
Figura 2. Imágenes de las soluciones de extractos de remolacha en polvo (Bt-Ext) al 1%
(p / p) preparadas en agua o tampón citrato 10 mM (pH 3,2 y 5), con o sin la adición de
polisacáridos a la misma concentración, durante el almacenamiento en ambiente.
temperatura (RT). Abreviaturas: goma arábiga (GA), pectina de remolacha (BP), goma
xantana (XG) y alginato de sodio (Alg).
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Fig. 3. Disminución de la absorbancia a 480 nm (betaxantinas; A y B) ya 530 nm (betacianinas; CD) corregido para absorbancia de fondo interna a 650 nm para soluciones de extracto de
remolacha en polvo al 1% (p / p) (Bt-Ext) con o sin 1% (p / p) de goma arábiga (GA), pectina de remolacha (BP), goma xantana ( XG) y alginato de sodio (Alg) en citrato de sodio 10 mM (pH
3,2 y 5). Los datos son promedios de la prueba de estabilidad térmica en placa por triplicado a 55 ° C en microplacas de 96 pocillos.
capacidad para estabilizar el color rojo a pH 3,2.
Para comprender mejor los mecanismos que imparten la estabilidad del color
rojo mediante los polisacáridos probados, investigamos la asociación de
betacianinas purificadas de Bt-Ext con los polisacáridos a través de QCM-D. Esta
técnica proporciona datos en tiempo real sobre las interacciones de la masa de la
superficie mediante la explotación de las propiedades piezoeléctricas de los
sensores de cristal de cuarzo. QCM-D se ha utilizado históricamente para analizar
interacciones biomoleculares que comprenden ADN, proteínas, grasas y células (
Dixon, 2008), y en el presente documento se evalúa la afinidad de unión entre los
sensores recubiertos de carbohidratos y los componentes de pigmento del polvo
de remolacha. Aunque se sabe que QCM-D es un sistema extremadamente
sensible a los cambios de masa y disipación en la superficie del sensor, no es
capaz de discriminar entre los tipos de moléculas depositadas en una superficie.
Por lo tanto, era necesario purificar las betacianinas rojo / magenta de Bt-Ext para
asegurar mejor que los eventos de unión observados estuvieran relacionados con
la unión del pigmento a las superficies recubiertas de polisacárido en lugar de
otros componentes del Bt-Ext.
Los aislados de betacianina se prepararon mediante una serie de pasos de
separación de exclusión por tamaño y de intercambio aniónico y la solución resultante se
analizó utilizando una variedad de técnicas espectroscópicas. Figura 6 muestra los
cambios en los espectros de absorbancia a lo largo de cada paso de la purificación. Aquí,
estos datos muestran que la suspensión de remolacha cruda tenía la misma absorbancia
en longitudes de onda indicativas de betaxantinas (480 nm) y betacianinas (530 nm),
mientras que la fracción de intercambio aniónico eluida con NaCl final tenía una
proporción aumentada de betacianina a betaxantina. Este aislamiento de betacianina fue
corroborado por el análisis LC-MS que indicó que el 50% de la masa asociada con los
primeros 5 minutos de la elución de LC consistía en productos de ionización relacionados
con betacianinas, mientras que los asociados con productos de ionización de betaxantina
comprendían menos del 1% de el total.
Además, los espectros FTIR en Figura 7 muestran que el polvo de remolacha
de origen original tenía bandas características fuertes para los carbohidratos en
Figura 4. Potencial zeta de soluciones al 0,1% (p / p) de extracto de
remolacha en polvo (Bt-Ext), goma arábiga (GA), pectina de remolacha
(BP), goma xantana (XG) y alginato de sodio (Alg) y sus combinaciones
preparadas en tampón de citrato de sodio 10 mM a pH 3,2 y 5. Las
barras representan promedios ± desviación estándar (n = 3). Las
estrellas grises denotan diferencias estadísticas significativas con el
extracto de remolacha original a pH 3. Las estrellas negras denotan
diferencias estadísticas significativas con el extracto de remolacha
original a pH 5.
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Figura 5. Tamaños promedio de partículas de soluciones al 0.1% (p / p)
de extracto de remolacha en polvo (Bt-Ext), goma arábiga (GA), pectina
de remolacha (BP), goma xantana (XG) y alginato de sodio (Alg) y sus
combinaciones preparadas en tampón de citrato de sodio 10 mM a pH
3,2 y 5. Las barras representan promedios ± desviación estándar (n =
3). Las estrellas grises denotan diferencias estadísticas significativas
para cada goma por sí sola en comparación con la versión complejada
a pH 3. Las estrellas negras denotan diferencias estadísticas
significativas para cada goma por sí sola en comparación con la
versión complejada a pH 5.
Figura 6. Espectros visibles de la suspensión de remolacha cruda, después del fraccionamiento por exclusión de tamaño y después de la fracción de intercambio aniónico con elución de NaCl.
Figura 7. Espectros ATR-FTIR de muestras liofilizadas de remolacha en polvo mediante el proceso de aislamiento de betacianina. Los espectros son conjuntos de datos únicos representativos de análisis
por triplicado en cada muestra.
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Figura 8. Datos de cambio de frecuencia de QCM-D para eventos de unión de betacianina a pH 3,2 (A) y pH 5 (B). Los datos representan eventos de lavado de tampón y unión experimental únicos que
son representativos de experimentos por triplicado para cada condición probada.
el 1500–900 cm−1 región, y particularmente a 980 y 1030 cm−1
(Garrigues, 2000). Las asignaciones de picos para los espectros ATR-FTIR de la
muestra purificada se etiquetan directamente enFigura 7 y se basan en el trabajo
dePérez, Ibarra, Guzmán y Lima (2017). En la muestra purificada final, es evidente
una gran reducción en los picos de carbohidratos. Los espectros de pigmentos
purificados exhiben picos dominantes asociados con NmiH vibraciones y CmiN se
estira; ambos presentes en las estructuras del pigmento de betacianina. Los
análisis mencionados anteriormente proporcionaron evidencia adicional de que el
pigmento se purificó adecuadamente para avanzar con los estudios de unión de
QCM-D.
Figura 8 muestra los cambios de frecuencia QCM-D vs tiempo para la
asociación de las betacianinas purificadas con sensores de oro recubiertos con los
polisacáridos seleccionados a pH 3,2 o 5 a temperatura ambiente (21 ° C).
Independientemente del pH, tanto Alg como XG mostraron una mayor afinidad de
unión por el pigmento en comparación con los otros polisacáridos. Además, se
observó que las masas más grandes de betacianina, según lo estimado por la
ecuación de Sauerbrey, se asociaban con los sensores recubiertos con Alg y XG (∼
300–400 ng / cm2 a pH 3,2 y ∼150–250 ng / cm2 a pH 5,0), y el pigmento también
pareció unirse irreversiblemente (∼75% de la masa total a pH 3,2 y ∼90% a pH 5,0)
después de un lavado con tampón en estos casos. En el caso de BP y GA, menos
masa asociada con las superficies recubiertas de polisacárido (100-200 ng / cm2 a
pH 3,2 y∼50 ng / cm2 a pH 5,0) y nada de esta masa se unió de manera irreversible,
siendo eliminada por completo tras la etapa de lavado; esto sugiere que
las interacciones de unión entre betacianina y BP o GA fueron relativamente
débiles.
Además, graficar los datos de QCM-D a medida que cambia la disipación vs
cambio de frecuenciaFigura 9) puede darnos una idea de la naturaleza
viscoelástica de las nuevas capas de pigmento-polisacárido que se están
formando. De esta forma aquí, las gráficas con la pendiente más baja indican las
interacciones pigmento-polisacárido que crean las capas más rígidas durante la
asociación. Este análisis de los eventos de asociación mostró que a pH 3.0 la unión
de la betacianina purificada a XG y Alg fue de naturaleza más rígida que la
asociación de betacianina con GA o BP, y sugiere que la interacción entre el
pigmento y estos polisacáridos probablemente también fue más fuerte. como más
significativo. En una nota menor, las variadas pendientes de las interacciones
pigmento-polisacárido sobre las interacciones pigmento-oro es una fuerte
indicación de que el evento de asociación observado es como tal y no pigmento
que llena los espacios en la capa de polisacárido en la superficie del oro.
Los resultados obtenidos con QCM-D proporcionan evidencia de apoyo a la
hipótesis de que una asociación de pigmento-polisacárido más fuerte e
irreversible puede desempeñar un papel crítico en la estabilidad de color superior
impartida por XG y Alg a temperaturas de almacenamiento. Se ha propuesto que
las gomas con pequeñas cantidades de cationes polivalentes, como Alg, pueden
formar puentes entre los grupos carboxilo y aumentar la estabilidad del complejo.
También se sugirió que los complejos y el pigmento pueden quedar atrapados
físicamente en matrices hidrocoloides de tal manera que se formaron en el
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Figura 9. Frecuencia vs gráficos de cambios de disipación para los eventos de unión de betacianina observados por QCM-D a pH 3,2 (A) y pH 5 (B). Los datos representan eventos de unión
experimentales individuales que son representativos del experimento de unión por triplicado para cada condición probada.
asociación de XG (Hettiarachchy, 1987). Además, las estructuras de Alg y XG son de
naturaleza relativamente lineal en comparación con las estructuras de GA y BP,
que son bastante ramificadas. Tales conformaciones lineales pueden presentar
mayores oportunidades para interacciones estables de unión intramolécula, como
asociaciones hidrofóbicas acopladas con enlaces de hidrógeno intermoleculares,
ya que probablemente crean menos obstáculos estéricos a los pigmentos que los
patrones de ramificación pesados presentes en BP y GA. Si bien la asociación
pigmento-polisacárido puede hacer una contribución importante a la estabilidad
del color impartida, se debe reconocer que existen otros posibles mecanismos que
pueden impartir estabilidad al pigmento.
En relación con BP, a pH alto (5,0) se muestra una alta densidad de carga y
una estabilidad de color cualitativamente buena, aunque QCM-D observó una
unión deficiente. Este resultado específico sugiere que podría existir un
mecanismo estabilizador diferente en este caso. El examen de los cambios en la
fluorescencia intrínseca de Bt-Ext cuando se combina con BP puede arrojar luz
sobre esto. Si bien no se observaron cambios significativos en los espectros de
fluorescencia del extracto de remolacha con la inclusión de Alg, XG o GA, se
observaron cambios significativos con la inclusión de BP a pH 5, que se muestran
enFigura 10. A este pH, la inclusión de BP resultó en una reducción significativa de
la fluorescencia en el rango de 330–370 nm y 300–330 nm, que son regiones
tradicionalmente asociadas con la fluorescencia del triptófano derivado del indol y
los aminoácidos de tirosina fenólica, respectivamente (Goldberg, Wissner, Klein y
Petersson, 2012). En BP, similar
Las estructuras fenólicas existen como sustituciones de éster de feruloilo en todo el
polisacárido y, al igual que el triptófano, las betacianinas también son derivados de indol.
Como consecuencia, aunque es posible que parte de la fluorescencia de Bt-Ext de control
pueda estar relacionada con las impurezas proteicas presentes, es probable que la fuerte
fluorescencia esté relacionada con las estructuras feruladas y betacianinas mismas. La
fluorescencia del indol a 355 nm se ha atribuido a formas desprotonadas, mientras que la
forma completamente protonada no emite fluorescencia (Bridges y Williams, 1968). La
supresión de la fluorescencia a 355 nm con la inclusión de BP puede sugerir que se
produce alguna interacción que afecta la fluorescencia de la betalaína, lo que podría
estar relacionado con la estabilidad del color observada en este caso.
4. Conclusiones
En general, la relación de los estudios simples de unión de pigmento-polisacárido en
el QCM-D con la mejora de la estabilidad del color, los cambios en el potencial zeta y los
cambios en el tamaño de las partículas observados para las soluciones de extracto de
remolacha que incorporan estos polisacáridos ha proporcionado una idea de los
mecanismos que pueden gobernar el Mejoras en la estabilidad del color. La observación
de interacciones de unión significativas entre el pigmento purificado y los dos
polisacáridos más estabilizadores del color apoya las nociones de que la formación de
complejos mejora la estabilidad del pigmento; y las mediciones del tamaño de partícula
que sugieren la formación de complejos entre los componentes del extracto de
remolacha y Alg se suman a este soporte. A pesar de esta correlación
233

9. M. Marchuk y col. Hidrocoloides alimentarios 93 (2019) 226–234
Figura 10. Espectros de emisión fluorescente para betacianina purificada, Bt-Ext, BP y Bt-Ext-BP después de la excitación a 290 nm. Los espectros presentados son representativos de
experimentos repetidos.
con la unión de pigmento-polisacárido, las estabilidades se relacionaron
adicionalmente con los potenciales zeta altamente negativos medidos en
soluciones de pigmento-polisacárido que mostraron una estabilidad de color
mejorada; esto incluye el uso de BP a pH 5 como estabilizador que no mostró
evidencia de formación de complejos con el pigmento. Este hallazgo es útil ya que
sugiere que más de un mecanismo puede conducir a la estabilización del
pigmento de la remolacha mediante la inclusión de polisacáridos aniónicos. Si
bien todos estos hallazgos tienen un alcance limitado, este trabajo justifica una
mayor investigación y sugiere que los estudios de unión de QCM-D tienen un gran
potencial para obtener una mejor comprensión de los sistemas de estabilización
de pigmentos, así como otras tecnologías de ingredientes alimentarios novedosos
donde se sospecha que se produce la formación de complejos. .
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Agradecimientos
Este trabajo ha sido apoyado por recursos dentro del Departamento de
Ciencias de los Alimentos de la Universidad de Cornell. Este trabajo se basa en una
investigación realizada en Cornell High Energy Synchrotron Source (CHESS), que
cuenta con el apoyo de la National Science Foundation con el premio
DMR-1332208.
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