1. INMUNODIFUSIÓN RADIAL
SEMINARIO INMUNOLOGIA
Grace Vanessa Pájaro – Marìa José Viera – Angie Sandoval Cifuentes
ANTECEDENTES
REACCIÓN ANTIGENO – ANTICUERPO (Ag-Ac)
Es una unión molecular entre el epitope (antígeno) y la
región hipervariable del anticuerpo, mediante
interacciones no covalentes o secundarias. Es
necesario recalcar que en caso de anticuerpos
monoclonales es necesario que estos tengan
complementariedad estructural con el epitope para
que se pueda ejercer la correcta interacción. Alguna
de las interacciones que ocurren entre estos son:
Puentes de hidrógeno
Fuerzas iónicas
Fuerzas de van der Waals
Hidrofobicas: constituyen el 50% de la fuerza
total
Entre más se complementan las configuraciones
moleculares, más uniones secundarias se forman
entre el antígeno y el anticuerpo y por lo tanto, es más
difícil que el complejo sea alterado por fuerzas tales
como la agitación térmica.
REACCIONES
En la unión Ag – Ac ocurre en dos reacciones las
cuales son utilizadas principalmente en las pruebas
serológicas
1. Formación del complejo Ag – Ac
2. Evidencia de esos complejos mediante la
observación de un fenómeno
FACTORES QUE AFECTAN LA FORMACIÓN DE
INMUNOCOMPLEJOS
pH
Temperatura
Fuerza iónica del medio
Características propias del Ac como la
afinidad, la avidez y la concentración relativa
de éstos en el medio
INMUNODIFUSIÓN
Es una técnica que puede determinar
cuantitativamente la concentración de un antígeno. Es
una técnica sensible que es usada clínicamente para
detectar niveles de proteínas plasmáticas o de
anticuerpos como IgG, IgM e IgA que hay en el suero
de un individuo y también para determinar fracciones
de C3 y C4 del complemento, entre otras.
La inmunodifusión pasiva se divide en
Inmunodifusión radial: si uno de los
reactivos, sea el Ag o el Ac, permanece fijo y
el otro se mueve y se une a él
Inmunodifusión doble: si el Ag o el Ac puede
moverse libremente en el medio
INMUNODIFUSIÓN RADIAL
Fue introducido por Mancini en 1965, empleaba la
difusión única para la medición de concentración de
antígenos, los procedimientos basados en esta
técnica son los más sencillos entre los actualmente
utilizados y su límite de detección es inferior a 100
mg/L.
Fundamento:
Se basa en la existencia de una relación cuantitativa
entre la concentración de Ag colocado en un pocillo
excavado en una placa de agar, que contiene el
anticuerpo correspondiente, y el halo de precipitación
resultante. En primer lugar, el área de precipitación
alcanzada está en función del tiempo transcurrido
desde la colocación del Ag y el momento de la lectura,
lo cual a menudo requiere de 48 a 72 horas de
difusión. Desde el comienzo de la difusión del
antígeno se va formando complejo Ag-Ac y
2. INMUNODIFUSIÓN RADIAL
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transcurrido el tiempo suficiente se alcanza el punto
final de difusión que se denomina zona de
equivalencia.
En segundo lugar, en el punto final de difusión, el área
del halo de precipitación es directamente proporcional
a la concentración del antígeno.
La calibración se establece usando varios
calibradores, que proporcionan una recta siendo:
𝑦 = 𝑎 + 𝑏 ∙ 𝑥
Siendo “y” el cuadrado del diámetro del halo, “b” la
pendiente de la recta, que es inversamente
proporcional a la concentración del anticuerpo en el
gel, “x” la concentración de masa de antígeno
aplicada en el pocillo, “a” el punto de corte de la recta
con la ordenada Y
La especificidad de la reacción dependerá de la
calidad y de la mono especificidad del antisuero
utilizado en el gel. Si no se cumple esta primicia se
puede aparecer más de un halo de precipitación. El
deterioro del material también puede dar como
resultado la formación de halos anómalos
INMUNODIFUSION RADIAL PRUEBA
Se trata de una reacción in vitro.
El agar noble es el gel utilizado para este
cultivo, generalmente este se prepara en
cajas de PETRI de 100x15mm.
PROCEDIMIENTO
1. Se prepara una solución de agar noble al
1% y con una solución amortiguadora
(buffer), el cual varía de acuerdo a la
enfermedad.
2. Se colocan 15ml de esta solución en la
caja Petri, se deja endurecer y se perforan
agujeros de 5.3mm de diámetro
formando 4 rosetas de 7 agujeros cada
uno.
3. Se coloca el Ag en el orificio del centro de
cada roseta y los sueros control positivo
,control negativo y sueros problema en
los orificios restantes
4. Entre los orificios que contienen sueros
control positivo o sueros problema con Ac
específicos contra la enfermedad
estudiada y el Ag, se forma una banda de
precipitación, la cual indica que se
efectuó una Rx Ag-Ac
5. Los complejos se precipitan formando un
anillo
3. INMUNODIFUSIÓN RADIAL
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NOTA:
La colocación de los controles varia en lugar y
numero de acuerdo a la enfermedad
estudiada
Las cajas de Petri con las muestras se
incuban a 30°c en cámara húmeda, la
lectura inicial de la prueba se efectúa a las
24h y la lectura final a las 48h
El área del anillo de la precipitación, medida
por el cuadrado del diámetro del anillo, es
proporcional a la [ ] del Ag.
INCONVENIENTES DE LA INMUNODIFUSIÓN
Es necesario que las concentraciones de Ag y
Ac sean similares o de lo contrario no se
alcanza la equivalencia y no se forma el
precipitado. El precipitado solo se forma en el
punto de equivalencia o cuando hay un ligero
exceso de Ag.
Las moléculas más pequeñas migran con
más rapidez que las de gran tamaño y
conforme la migración continúa el precipitado
puede re disolverse y volverse a formar de
acuerdo con los cambios de concentración de
Ag o Ac en el gel.
Si hay grandes cantidades de Ac, el antígeno
no se difunde muy lejos antes de alcanzar la
equivalencia y el anillo es más grueso o
espeso.
ALTERACIÓN EN LA CONCENTRACIÓN DE
ALGUNAS PROTEÍNAS SÉRICAS Y SU
RELACIÓN CON ALGUNA PATOLOGÍA.
IgA: cirrosis, infecciones crónicas, mieloma,
fiebre, síndrome de inmunodeficiencia
adquirida, hígado graso, inflamación, etc.
IgG: enfermedades infecciosas crónicas,
mieloma, mononucleosis infecciosa, Kala-
azar, Lepra Es la más abundante (80% del
total de inmunoglobulinas). Se une
rápidamente con macrófagos y neutrófilos,
provocando la destrucción del
microorganismo. Puede atravesar la barrera
placentaria y se secreta en la leche materna.
Por ello, es responsable de la inmunidad
fetal y la del recién nacido
IgM: hepatitis aguda, infecciones aguda,
mieloma
IgE: tumores, bronquitis, dermatitis atópica
La cuantificación de IgE requiere de métodos
de mayor sensibilidad debido a su baja
concentración
Patología de C3: reacciones inflamatorias
agudas, infecciones recurrentes con
bacterias piógenas, glomerulonefritis
Patología de C4: angiedema hereditario
