Procesamiento de tejidos histologicos

1. DOCENTE
LIC. IVAN PEÑAFIEL
TEMA:
PROCESAMIENTO DE TEJIDOS:
FASES (FINALIDAD Y OBJETIVOS), LÍQUIDOS UTILIZADOS O SUSTITUTOS
(VENTAJAS Y DESVENTAJAS),
TIEMPOS DE CADA UNO (OPCIONES Y TEMPERATURAS)
ALUMNA
PAOLA VARGAS
SEGUNDO SEMESTRE A
RIOBAMBA
2013

2. PROCESAMIENTO DE TEJIDOS

4. 1.- RECEPCIÓN DE LA MUESTRA
El manejo y procesamiento de las biopsias y piezas quirúrgicas comienza en la sala de operaciones o
en la consulta médica; la enfermera tiene la responsabilidad de preguntar con anticipación al
cirujano si el material requiere examen urgente, cultivos, fotografía o cualquier examen especial.
La realización de biopsias transoperatorias o por congelación será programada por el Servicio de
Cirugía y comunicadas a Patología en el parte diario.
En quirófanos o en la consulta, se dispondrá de
recipientes de diferentes tamaños, plásticos con
tapa hermética y fijador (formol buferado al 10%);
por lo general el residente que asiste al acto
quirúrgico es el responsable directo de hacer los
pedidos o solicitud del examen histopatológico, el
nombre y sello del solicitante es fundamental para
reclamos y aclaraciones futuras.
Es muy importante que el Servicio de Patología
elabore un instructivo para la toma, manejo y
envío de las muestras, los recipientes, formularios,
horario etc. y sea enviado a la persona
responsable de quirófanos para su estricto
cumplimiento.

6.  La descripción macroscópica estará a cargo del patólogo y del
residente de segundo año de post-grado bajo tutoría. Deben
utilizarse términos anatómicos, palabras y frases concretas y
precisas, de tal manera que quien lea pueda reconstruir
mentalmente los datos fundamentales.
2.- DESCRIPCIÓN MACROSCÓPICA

7. LA DESCRIPCIÓN MACROSCÓPICA DEBE SER LO MÁS DETALLADA POSIBLE Y
CONCRETA EN EL USO DE LOS TÉRMINOS.
SE IDENTIFICARÁ
lugar el origen
del tejido,
las medidas en
sus ejes
mayores,
el peso,
una descripción
de la superficie
externa
indicando las
características
visuales,
la consistencia
al tacto, el color
de la superficie
y
las estructuras
anatómicas
adheridas,
características
de la neoplasia,
etc.

8. LUEGO SE DESCRIBIRÁ LA
SUPERFICIE DE CORTE INDICANDO
la uniformidad del
tejido o la presencia
de cavidades,
áreas de
hemorragia,
necrosis,
calcificaciones,
tumores, etc.
Cuando una pieza es de características difíciles para una descripción clara, se debe
recurrir al uso de esquemas o dibujos sobre imágenes anatómicas normales.

9. TAMAÑO, MEDIDAS Y PESOS
Las medidas se
toman en los ejes
mayores, en
centímetros.
Entre varias
muestras se
tomará el
tamaño
referencial entre
el mayor y el
menor.
El peso de todo
el material se
toma en gramos.

11.  FIJADOR
3.- PROCESAMIENTO DE TEJIDO
Una vez extraída la pieza quirúrgica o biopsia debe ser
colocada en el fijador (formol buferado al 10%) cuando la pieza
quirúrgica requiere de fotografías, esta debe preservarse en
refrigeración a 4 grados C, para evitar de esta manera los
cambios histológicos y no alterar los tejidos.
• Sin embargo se debe tomar una sección representativa y fijarla
inmediatamente para evitar daños en el tejido especialmente para pruebas
de inmunohistoquímica y patología molecular.
El recipiente con la muestra debe estar debidamente rotulado
con el nombre del paciente, con letra legible, sitio de origen de
la muestra y fecha.

12. LAS SOLUCIONES FIJADORAS
TIENEN POR OBJETO PRECIPITAR
las proteínas,
aumentar la consistencia de los tejidos,
inactivar las enzimas proteolíticas
inhibir el crecimiento bacteriano
y por lo tanto, preservar la constitución
química y la morfología de los componentes
titulares.

13. SE PUEDEN CLASIFICAR EN LOS
SIGUIENTES MÉTODOS:
Por inmersión: pequeños
trozos del tejido son
sumergidos en el líquido
fijador.
Por perfusión: el
líquido fijador se
aplica por inyección
vascular.
Por vapores: consiste
en utilizar líquidos
fijadores que emitan
vapores, se debe
realizar bajo
campana extractora
de gases.

14. La mayoría de las
sustancias
fijadoras son
tóxicas por inhalación
o por contacto,
algunas de ellas
cancerígenas. Hay que
seguir las indicaciones
de seguridad para su
manejo y utilización.

15. ETANOL: CH3-CH2-OH
Fija por deshidratación y se usa
entre el 70 y 90 %.
Es un buen elemento para
preservar moléculas, como
ciertas enzimas, propiedades
antigénicas, glucógeno,
pigmentos y para las extensiones
citológicas.
Debido a que deshidrata, a la vez
que fija, se puede usar también
como un conservante de las
muestras. Tiene inconvenientes
como el endurecimiento y la
retracción de los tejidos. Carece
de efecto mordiente.

16. ÁCIDO ACÉTICO: CH3COOH
Su proceso de fijación consiste
en cambiar el estado coloidal
de las proteínas. Se utiliza a
una concentración que varía
entre el 1 y el 5 %.
Es el fijador ideal para ácidos
nucleicos y nucleoproteínas.
Como inconvenientes cabe
destacar la destrucción de las
mitocondrias y mala fijación
de membranas y citoplasma.
Se suele usar en combinación
con otros fijadores

17. FORMALDEHÍDO: CH2=O.
Actúa mediante la formación de puentes
entre las moléculas tisulares. Se utiliza a
concentraciones próximas al 4 %.
Es un fijador ampliamente usado por la
buena preservación del tejido, actúa
como conservante, produce poca
retracción tisular, es un buen fijador para
lípidos, es compatible con la mayoría de
las tinciones histológicas, incluidas las de
inmunocitoquímica e hibridación de
ácidos ribonucleicos.

18. GLUTARALDEHÍDO.
Forma puentes entre las
moléculas de los tejidos. Se usa
a una proporción de entre el 0,5
y el 3 %.
Tiene una alta capacidad para
preservar la estructura celular,
por lo que es el fijador de
referencia para observación de
ultra estructuras celulares con
el microscopio electrónico.
Pero hay que tener cuidado con
su baja penetración tisular y
puede producir retracciones.

19. MEZCLAS CON FORMALDEHÍDO:
El formaldehído es quizá el fijador más usado
hoy en día, tanto para técnicas histológicas
rutinarias como para otras como la
inmunocitoquímica o la hibridación de ácidos
nucleicos. Lo más frecuente es utilizarlo en
solución al 4 % junto con otros fijadores.
Por ejemplo, el Bouin. Se suelen disolver en
soluciones tamponadas que tienen una
osmolaridad similar a la del tejido que se
pretende fijar. Para fijaciones de tejidos
destinados a microscopía electrónica se
suelen utilizar soluciones fijadoras que
contienen formaldehído y glutaraldehído.
La función del formaldehído es iniciar una
fijación rápida, por su mayo capacidad de
penetración, mientras que el glutaraldehído
realizará una fijación más poderosa, pero
más lenta que afectará a la estructura tisular
puesto que el formaldehído ya ha realizado
una fijación previa.
Glutaraldehído-tetróxido de osmio:Los
fijadores en combinación no tienen
necesariamente que usarse al mismo tiempo.
Es habitual que los tejidos destinados a
microscopía electrónica sean inicialmente
fijados en glutaraldehído (1 al 3 %) y
paraformaldehído (2 al 4 %), para
posteriormente ser postfijados en tetróxido
de osmio al 1 % en solución tamponada.
Este último es un buen preservador de la
ultraestructura celular, sobre todo
membranas, en cooperación con los
aldheídos. Esto es importante porque el
proceso para microscopía electrónica supone
incubar el tejido en solventes orgánicos y
polimerización de resinas a 60 °C, durante las
cuales el tejido debe ser preservado.

20.  DESHIDRATACIÓN
3.- PROCESAMIENTO DE TEJIDO
Luego de que la muestra ha sido fijada se debe eliminar el
fijador y deshidratar. Para esto se utiliza una serie gradual
de soluciones acuosas con una concentración de menor a
mayor del agente deshidratante
se prefieren los alcohol es etílico e isopropìlico, El uso de
los cuales no están en la lista de sustancias controladas.
Alcoholes graduados que vayan de la concentración más
baja hasta la más El uso de procesadores automáticos
perfeccionan el alta es de rutina. Procesamiento,
utilizando calor, vacio, presión y agitación.

21. LA DESHIDRATACIÓN DE LOS
TEJIDOS TIENE DOS FINALIDADES
Un endurecimiento de las
muestras
Extraer el agua del interior de las
muestras para que la parafina ó las
resinas (epon), que no son miscibles
con el agua, puedan penetrar
posteriormente en el proceso de
inclusión

22.  ACLARAMIENTO
3.- PROCESAMIENTO DE TEJIDO
Tiene que ser afines tanto
con el agente deshidratante
(alcohol) como con el agente
infiltrante (parafina)
El líquido comúnmente
utilizado es el xilol. Esta
etapa se llama Aclaramiento
debido a que el tejido se
vuelve transparente.
Posterior a la deshidratación
el tejido se debe sumergir
en un líquido que sea
miscible tanto en el medio
de inclusión como en el
medio de deshidratación.

23. XYLENE
LIQUIDOS LOS MÁS UTILIZADOS
SON
Más utilizado
Se pone opaco
(lechoso) cuando
está contaminado
con agua
Reemplazar
inmediatamente
Endurece el tejido
TOLUENO
Endurece menos el tejido
Tolera más la presencia de
agua
Las procesadoras automáticas
condensan agua en la tapa que
con los cambios de presión
causan que le caiga agua al
tejido durante los últimos
pasos del procesamiento

24. BENCENO
LIQUIDOS LOS MÁS UTILIZADOS
SON
Rápida
evaporación
Difícil de
mantener
Tóxico,
carcinógeno
CLOROFORMO
Lenta
penetración al
tejido
Rápida
evaporación
Difícil de
mantener

25. LIMONENE (Sustituto de Xileno)
LIQUIDOS LOS MÁS UTILIZADOS
SON
Endurecen
el tejido
Contaminan
la parafina
Alergias
Dificultad
respiratoria
Dolor de
cabeza
HIDROCARBONOS ALIFÁTICOS
Alkanes
Nueva clase
de agentes
clarificanes
Cadenas
cortas
Unas MARCAR
mejores que
otras…

26.  INFILTRACIÓN O INDUCCIÓN
3.- PROCESAMIENTO DE TEJIDO
Para poder obtener cortes delgados que puedan
ser observados al microscopio óptico, los tejidos
deben ser incluidos en una sustancia de
consistencia firme, la cual puede ser hidrófila o
hidrófoba.
Un medio hidrófobo que se puede utilizar es
la parafina. Este último es una parafina
altamente purificada a la cual se le han
agregado cantidades variables de polímeros
especiales, lo cual le dará distinta dureza y
plasticidad al taco de inclusión.

27.  PARAFINA
Mas común
Sustancia inerte
Derivado del petróleo
Varían en su punto
(temperatura) de fusión
[melting point]
IHQ usamos con bajo
punto de fusión (55-
58ºC) protege antígenos
buenas cintas
Demasiada infiltración
causa achicamiento y
endurecimiento

28.  La inc lu sió n co nsist e e n imp r e g na r lo s t e jid o s e n u na sust a nc ia líq u id a , q u e p e net r e e n e l int e r io r d e la mu e st r a y
o c u p e lo s lu g a r e s d e l a g u a e xt r a íd a , y p o st e rio rme nt e p a se a u n e st a d o só lid o
 R a z o ne s d e p o r q u é ha y q u e d a r e st e p a so
 E st e p ro c e d imie nt o s e r e a liz a p a r a qu e la s mu e st r a s a dq u ie r a n u na dur e za d et e r mina d a y u na e st a bilid a d ho mo g é ne a y
a sí p o d e r o bt e ne r c o r t e s fino s y u nifo r me s p a r a p o d e r lo s e st u d ia r c o n e l mic r o sc o p io ó p t ic o o e le c t r ó nic o .
4.- INCLUSIÓN
Parafina.
Como medio de inclusión la
parafina es la sustancia más
utilizada. Es una cera que tiene
un punto de fusión entre 45º y
60º C y que solidifica a
temperatura ambiente.
Permite secciones de 3 5 micras
para estudio con microscopio
óptico
Plásticos
(epon).
La inclusión en resinas acrílicas
se basa en la polimerización de
una sustancia de bajo peso
molecular y su transformación
en un producto transparente y
sólido de mayor dureza que la
parafina.
Debido a la dureza de los
bloques así obtenidos es posible
realizar cortes de 50 Å con
cuchillas de vidrio para estudio
con microscopio electrónico.

29. CLASIFICACIÓN DE LOS MEDIOS DE
INCLUSIÓN:
1. HIDRÓFOBOS O
ANHIDROS:
• Se utilizan previa deshidratación de las
muestras y pasajes por líquidos que sean
miscibles con el deshidratante y con el
medio de inclusión.
• Ejemplos:parafina,paraplast,resinas
epoxi,resinas
acrílicas,celoidina,paraplast-celoidina
2. HIDRÓFILOS O ACUOSOS:
• Se utilizan inmediatamente después del
proceso de fijación y del lavado de las
muestras en agua
• Ejemplos:carbowax,gelatina,agar

30. FACTORES QUE AFECTAN EL
PROCESO DE INCLUSIÓN:
El grosor de la muestra (ideal 1.5 a 5 mm de grosor para
microscopía de luz)
La naturaleza del tejido Ej: tejidos densos como el cerebro,
huesos, piel, requieren tiempos más largos que el riñón.
El fijador utilizado (si es coagulante o aditivo).
Los deshidratantes o líquidos intermediarios utilizados
El uso de vacío, a presión reducida, puede disminuir a la mitad el
tiempo de impregnación en el medio de inclusión.
La temperatura, el calor aumenta el intercambio de líquidos,
pero endurece los tejidos y provoca retracción
La viscosidad de los reactivos utilizados es directamente
proporcional a los tiempos utilizados.

32.  Se deben procesar los cortes suficientes de las lesiones más
representativas. La toma de los cortes se facilita cuando las piezas
han tenido un tiempo suficiente de fijación, para lo cual vale
recordar lo siguiente:
5.- CORTE
1. El tamaño de la
muestra y el
volumen del
fijador.
2. El espesor de la
muestra y la
penetración del
fijador.
3. El contacto del
fijador con la
superficie de la
muestra.
4. El tipo de fijador
y el tiempo de
fijación.

33. .
IDENTIFICACIÓN DE LOS CORTES
En cada cápsula o caseta porta tejidos deben colocarse los cortes tomados o “muestras”,
identificados con una tira de papel.
Debe escribirse, con lápiz de grafito, el número de identificación correspondiente junto con las
iniciales del paciente y a continuación, con letras y/o números, los diferentes cortes que se
describen en el protocolo macroscópico como son: borde de resección, lados, niveles, regiones
anatómicas, etc.
Con equipo especial se podrá imprimir en la caseta de plástico el número y las referencias en
código de barras.
Los cortes que se van obteniendo se deben ir estirando, esto se puede realizar en un baño
termoregulado (40-45 ºC). El estiramiento se basa en la dilatación de la parafina producto del calor

35.  Luego estos cortes se van recogiendo con un portaobjetos.
6.- PESCA

36. 7.- DESPARAFINIZACIÓN
Desparasitación de los cortes, la que se
necesita desparafinar para que pueda ser
hidratado el corte de tejido, esta se
realiza a través de distintos baños en xilol,
por un tiempo determinado.

37. 7.- DESPARAFINIZACIÓN
Rutinariamente se utiliza la coloración clásica de hematoxilina eosina. El uso
de coloraciones especiales depende de los datos clínicos y de los hallazgos y
sospechas patológicas.
Para las biopsias de piel, riñón, hígado y médula ósea se utilizarán de rutina,
además de H&E, las coloraciones de PAS y tricrómico de Masson, hierro,
reticulina, mucicarmin, Giemsa, Pas alcian blue, fibras elásticas, rojo congo,
plata (Jones) etc.
• En las biopsias pulmonares, además de las tinciones rutinarias H&E, fibras elásticas, tricrómico
deben emplearse las tinciones para hierro y otros.
• Es indispensable contar con casos controles.
• A continuación describimos algunas técnicas para coloración de hematoxilina-eosina. Para
tinciones especiales recomendamos revisar la bibliografía, particularmente en lo referente a
tinciones histoquímicas para músculo y sistema nervioso.

38.  Por el uso restringido del cloruro de mercurio, es preferible adquirir
hematoxilina en solución preparada y madurada sin la adición de
óxido rojo de mercurio, sin embargo cuando no sea posible conseguir
se describe a continuación la formula:
SOLUCIÓN DE COLORACIÓN
RUTINARIA DE H&E

42. 9.- MONTAJE
Luego de teñir el tejido este debe ser
deshidratado nuevamente, para esto hay
que pasarlo por una serie de alcoholes en
grado ascendente.
Posteriormente hay que pasar el tejido por
xilol, de modo de hacerlo miscible con el
medio de montaje. Finalmente se le agrega
el medio de montaje y se le coloca el
cubreobjetos, teniendo cuidado en no dejar
burbujas.