transcripcion de biomol

1. Clonación es una técnica por la que podemos generar
múltiples copias de un fragmento de DNA
¿Para qué?
producir grandes cantidades de una proteína con fines
industriales
investigación básica:
estudio de la función de la proteína
regulación de la expresión
análisis de complementación
aislamiento para estudios bioquímicos
mutagénesis in vitro

2. Tema 7. Clonación
¿Para qué clonar?
Estrategia general:
1.Generación del fragmento a clonar
2.Elección del vector
plásmidos
fago L
fago M13
3.Ligamiento
4.Transferencia a la célula huesped
5.Selección de los recombinantes

3. UNIDAD 7: TECNICAS DE BIOLOGIA MOLECULAR
APLICADAS A LA MEDICINA

4. Clonación es una técnica por la que podemos generar
múltiples copias de un fragmento de DNA
¿Para qué?
producir grandes cantidades de una proteína con fines
industriales
investigación básica:
estudio de la función de la proteína
regulación de la expresión
análisis de complementación
aislamiento para estudios bioquímicos
mutagénesis in vitro

5. 1.Generación del fragmento a clonar
enzimas de restricción tipoII: reconocen secuencias específicas
dejando extremos cohesivos

6. 1.Generación del fragmento a clonar
enzimas de restricción tipoII: reconocen secuencias específicas
dejando extremos romos

7. Nomenclatura

8. Análisis de los fragmentos de DNA en geles de agarosa
_
+
composición de los geles
agarosa
hevir
verter en molde
solidificar
+
tampón

9. Factores que afectan a la velocidad de migración de los
fragmentos de DNA en geles de agarosa
a. tamaño: la velocidad de migración del fragmento es
inversamente proporcional al log del nº de pares de bases

10. patrón

11. b. concentración de agarosa: la velocidad de migración
del fragmento es menor a mayor concentración.
El rango de separación de tamaños varía
distancia
mm

12. d. voltaje aplicado: la velocidad de migración es proporcional al voltaje aplicado
condiciones standar son 5v/cm
e. composición de bases: no afecta a la migración
f. composición del tampón: la velocidad de la migración es mayor a mayor fuerza
iónica
(en agua la conductividad es nula)
Tampones mas usados son
Tris-Acetato (TAE)
Tris-Borato (TBE)

13. g. dirección del campo eléctrico
-
+
-
-
- +
+
+
-
+
campo pulsante
(PFGE)
para separar fragmentos
50-100Kb
“lo normal”

14. Análisis de los fragmentos de DNA en geles de agarosa
cuantificación de la cantidad de DNA
partir de una banda de DNA patrón
visualización de los fragmentos de DNA
tinción con Bromuro de Etidio: molécula fluorescente que se
intercala entre la s bases de la molécula de DNA
absorción a 330 nm (UV) emisión en luz visible (anaranjado)
patrón
ng kb
100 23
50 9
200 6
10 2
musetra
5µl
¿qué cantidad de cada uno de los fragmentos
tenemos en la muestra?
¿qué tamaño tiene cada uno de los fragmentos?
a
b

15. Recuperación de los fragmentos de DNA en geles de agarosa
DNA
+ GELasa ó
AGARasa
filtro
centrifugar

16. 2. Elección del vector de clonación
Fagómidos
Plásmidos Fago  DNA ds
Fago M13 DNAss

17. Plásmidos: moléculas circulares de DNA con un origen
propio de replicación
nº de copias: 1-2/5-6 bajo-medio
10-20 alto pBR322
200-1000 muy alto pUC18

18. Aislamiento de plásmidos
gran escala
mini-prep
a partir de una colonia
Protocolo
lisis: NaOH ó 100ºC
lisocima
detergente
DNA
bacterias
restos celulares
gradientes de cloruro de cesio+ Bromuro de Etidio
El BrEt se intercala entre las bases de la molécula de DNA

19. DNA lineal
(cromosoma,
plásmido L y OC)
DNA superenrollado
(plásmido CCC)
Gradiente de ClCs
+
BrEt
DNA CCC+ BrEt aumenta
su densidad

20. Extracción- purificación-concentración de DNA
Protocolo general
DNA en solución
(de lisis ó tampón)
+ etanol
DNA precipita
eliminamos sobrenadante
resuspendemos DNA precipitado en el tampón adecuado
1 2 3
5
1
4

21. CREACION DE BIBLIOTECAS
GENOMICAS
El ADN del fago lambda es una molécula lineal
de 48,5 kb que termina en dos extremos cohesivos
constituidos por 12 nucleótidos; que se denominan
«secuencia cos»
una parte del genoma depuede ser reemplazado

22. Aislamiento del fago: Ciclo lítico del fago 
lisis
restos
celulares
partículas
de fago

23. 1.Tratamiento del fago con fenol/SDS para desnaturalizar proteínas de
la cabeza y cola
2.Corte con las enimas de restricción (EcoRI)
3.purificación del DNA de los brazos
por electroforesis
por gradiente de sacarosa tras ligar los extremos cos
4.Ligamiento con el fragmento a clonar
5.Empaquetamiento in vitro del DNA de fago  recombinante y selección
Aislamiento del DNA del fago y clonación de un fragmento
brazo izquierdo 20kb brazo derecho 8-10kb
15-20 kb
cos
cos
cos
EcoRI EcoRI
EcoRI EcoRI

24. Empaquetamiento Selección

25. fago M13 como vector

26. Fagómidos

27. 3. Ligamiento
formación de nuevos
puentes entre los extremos
5’-P y 3’-OH

28. Desfosforilación del vector: fosfatasa alcalina
Como mejorar la reacción de ligamiento
Ligamiento como una reacción bimolecular en dos etapas
1º reacción intermolecular entre el vector y el fragmento
2º reacción intramolecular
favorecida por una elevada concentración de extremos
favorecida por una baja concentración de extremos
vector 50 µg + fragmento 100-150 µg

29. transformación bacteriana
crear “huecos” en pared y membrana
celular para que entre el DNA exógeno
4. Transferencia a la célula huesped
tratamiento con cloruro cálcico
electroporación

30. 5. Selección de los recombinantes
Inactivación de la resistencia a algún antibiótico: pBR322
Complementación : E. coli M15/ pUC18 en placas X-gal
Comprobación de los recombinantes
Análisis de restricción de los plásmidos recombinantes
Líneas 6, 7, 9 y 10: vectores no recombinantes
Línea 1: plásmido pKT49 digerido con la enzima BamH1
Líneas 2, 3, 4, 5, 8 y 11: plásmidos con insertos de ADN