1. Caracterización de las variantes de la proteína circundante del esporozoito (CSP) en
aislados de Plasmodium vivax provenientes del Edo. Sucre, Venezuela
Durrego E.1,2, Hidalgo M.1, De la Rosa M.1, Pérez H. A.1
1 IVIC, Centro de Microbiología y Biología Celular. Caracas, Venezuela. 2 USB, Departamento de Biología Celular.
Caracas, Venezuela. 3 UCV, Facultad de Ciencias. Caracas, Venezuela
Introducción Resultados y Discusión
La malaria es la enfermedad tropical más importante del mundo, con más de 200 millones de casos El producto de amplificación del gen pvcs empleado en el análisis por RFLP, estuvo entre 600 y 700 pb . La
clínicos y cerca de un millón de defunciones. La enfermedad se atribuye a cinco especies de Plasmodium: digestión de los productos de PCR con las enzimas de restricción se realizó por pares de muestras. Los
P. falciparum, P. vivax, P. malariae, P. ovale y P. knowlesi Las dos primeras son la causa más frecuente de análisis efectuados con los 24 aislados investigados determinó la pertenencia del 100% al genotipo VK210
la enfermedad, pero entre todas, P. vivax tiene la mayor cobertura geográfica, con transmisión en de pvcs. La secuencia de estas muestras fue reconocida por la enzima AluI (figura 3), mientras quedó
territorios de clima tropical y templado, pertenecientes a unos 95 países. Plasmodium vivax es el principal intacto en presencia de la enzima BstNI (figura 4).
agente palúdico en América Latina donde causa más del 70% de los casos y en la región significa riesgo
de transmisión en una superficie cercana a los diez millones de km2. Este parásito es también la causa
primordial de paludismo en Venezuela. Según fuentes del MPPS, durante el decenio 2001-2010, se
diagnosticaron en Venezuela 371.473 casos de malaria, 82% fue debido a P. vivax. El control de la malaria M 1 2 3 4 5 6 M 1 2 3 4 5 6
por P. vivax en el mundo deviene complicado por las peculiaridades de sus estadios hepáticos crípticos
(hipnozoitos) y la dinámica de la gametocitemia durante el desarrollo eritrocítico. Desde finales de los 80, 500 pb
500 pb
la situación se ha tornado más compleja por el surgimiento de P. vivax resistente a la cloroquina o de
virulencia acentuada, en varias zonas geográficas.
El Edo. Sucre, al nor-oriente del país origina la mayoría de los casos del foco malárico oriental con
transmisión exclusiva de P. vivax, el vector principal es Anopheles aquasalis. Para el 2002, Sucre aportaba
casi la mitad del total nacional de casos de malaria. A partir del 2003, luego de una cura masiva la
incidencia de malaria en Sucre ha declinado, pero todavía en el 2009, cinco municipios alojaban más de
Figura 3. Incubación de los productos de PCR con Figura 4. Incubación de los productos de PCR con
100 lugares con transmisión. la enzima AluI durante toda la noche. Carril 1, la enzima BstNI durante toda la noche. Carril 1,
Pv531; 2, Pv533; 3, Pv534; 4, Pv537; 5, Pv538; 6, Pv531; 2, Pv533; 3, Pv534; 4, Pv537; 5, Pv538; 6,
La proteína CSP que reviste a los esporozoitos de Plasmodium spp., es uno de los antígenos considerados Pv545. M, marcador de peso molecular 100 pb Pv545. M, marcador de peso molecular 100 pb
Promega®. Promega®.
prometedores para desarrollar una vacuna antipalúdica. La estructura de la CSP muestra una región central
repetida flanqueada por dos regiones conservadas, pero contrario a P. falciparum, el gen pvcs tiene una
diversidad genotípica en la región central repetida que determina dos variantes de la proteína: VK210 y La amplificación del gen pvcs con el par de cebadores CS1 y CS2 originó un producto de ≈ 1230 pb. La
VK247. Ambas circulan en las áreas endémicas de vivax. El tipo VK210 muestra el motivo repetitivo traducción del gen pvcs en la correspondiente secuencia de aminoácidos evidenció la presencia de un
[GDRADGQPA] mientras VK247, porta la repetición [ANGAGNQPG]. El objetivo principal de este estudio motivo repetido [GDRA(A/D)GQPA], el cual es característico de VK210 de la CSP de P. vivax. Ninguna de
fue determinar los genotipos del gen pvcs en aislados circulantes en el estado Sucre. Adicionalmente las cuatro secuencias analizadas tuvo polimorfismo en cuánto al número de repeticiones de este motivo,
obtuvimos la secuencia del gen para cuatro aislados y analizamos la variabilidad local. pues en todas fueron diecinueve. La distribución de los motivos VK210 (GDRAADGQPA o GDRADGQPA),
es conservada en las cuatro secuencias analizadas (tabla 1).
Metodología
El ADN de P. vivax se obtuvo a partir de muestras de sangre infectadas con P. vivax obtenidas de sujetos
adultos infectados en el estado Sucre. La obtención de las muestras fue por donación voluntaria, bajo la M 1 2 3 4
modalidad de consentimiento informado. Todos los pacientes tuvieron un diagnóstico de malaria a cargo de
microscopistas especializados. Luego, confirmado mediante diagnóstico molecular. Un ensayo de
PCR/RFLP1 fue aplicado a la tipificación de 24 aislados de P. vivax originados en el estado Sucre. Dicho
método detecta mínimas variaciones en un gen en el que la sustitución de una base, o crea un lugar capaz
de ser digerido por una enzima de restricción o anula un lugar de restricción. La técnica de PCR es
utilizada para amplificar una región de un gen que contiene uno o múltiples lugares de restricción, siendo
posteriormente digeridos los productos amplificados por una o varias endonucleasas de restricción. El
Figura 5. Amplificación del gen pvcs en aislados de P. vivax provenientes del Edo.
método de PCR/RFLP y las enzimas de restricción utilizadas son ilustrados por la figura 1. Sucre. Carril 1, Pv502; 2, Pv531; 3, Pv532; 4, Pv542. M, marcador de peso molecular
100 pb Promega®.
Tabla 1. Distribución de la secuencia de aminoácidos en la región repetida de CSP de P. vivax
1 = GDRADGQPA
2= GDRAAGQPA
Figura 1. Esquema de amplificación y de RFLP del gen cs
El análisis por PCR/RFLP indica que las muestras de P. vivax procedentes del Edo. Sucre presentan la
CEF-CER Cebadores externos sentido y antisentido variedad VK210 de la proteína CS. La secuenciación del gen que codifica para esta proteína en cuatro
CIF-CIR Cebadores internos sentido y antisentido
Gen cs (variante VK210) Fragmento de 699 pb
de estos aislados clínicos, confirmó la identidad de la variante conforme a las secuencias publicadas en
Gen cs (variante VK247) Fragmento de 726 pb el GeneBank. Resultó interesante que las secuencias se encontraron bastante conservadas tanto en su
AluI, BstNI Enzimas de restricción de reconocimiento para las variante VK210 y VK247 respectivamente. Los cortes originan fragmentos <200 pb,
fácilmente distinguibles en tamaño de los productos de PCR sin digerir. En la parte superior del dibujo se representa el esquema de cortes si la secuencia aminoacídica y sin polimorfismo de tamaño en la región repetida. Ello tal vez tiene relación
variante del gen cs correspondiera a VK210, y en la parte inferior se representa el esquema de cortes si la variante del gen cs correspondiera a con la transmisión exclusiva de este genotipo por Anopheles aquasalis, en la región.
VK247.
Rn Sitio de corte para las enzimas de restricción
La secuencia completa del gen se obtuvo a partir de cuatro aislados de P. vivax provenientes del Edo.
Sucre. La amplificación completa del gen pvcs (figura 2),utilizó los cebadores CS1 y CS22. El producto de
PCR obtenido fue secuenciado por el servicio Macrogen de Korea: El alineamiento de las secuencias de
pvcsp se realizó con el programa ClustalW, y para la visualización de los dominios repetidos del gen, se
utilizó Prosite Referencias Bibliográficas
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Figura 2. Representación esquemática del gen pvcs