epa

1
UNIVERSIDAD DE CHILE
FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS Y FARMACÉUTICAS
DEPARTAMENTO DE QUÍMICA ANALÍTICA E INORGÁNICA
LABORATORIO DE QUÍMICA ANALÍTICA DE RESIDUOS DE PESTICIDAS Y
ELEMENTOS TRAZA.
“OPTIMIZACIÓN DE LA EXTRACCIÓN ASISTIDA POR MICROONDAS
ASOCIADA A EXTRACCIÓN EN FASE SÓLIDA PARA LA
DETERMINACIÓN DE PLAGUICIDAS EN ACEITES DE OLIVA Y PALTA”
MEMORIA PARA OPTAR AL TITULO DE
QUÍMICO
JUAN DANIEL DÍAZ SANTIBÁÑEZ
Santiago-Chile
2009
DIRECTOR DE TESIS
Dr. EDWAR R. FUENTES PEREZ
PROFESOR PATROCINANTE
Dr. EDWAR R. FUENTES PEREZ

2
Ves cosas y dices,"¿Por qué?" Pero yo sueño cosas que nunca fueron y digo, "¿Por qué no?".
George Berrnard Shaw

3
AGRADECIMIENTOS
Yo Juan Daniel Díaz Santibáñez quiero agradecer:
A Dios, por permitirme estar rodeado de esta gente tan importante para mí.
A mis padres, por su continuo esfuerzo y sacrificio para procurarme siempre lo mejor.
A mis hermanos, por ser como son y por aguantarme.
A mis abuelitos, por todo el cariño y la sabiduría que me han entregado.
A mis tíos, especialmente a mi tía Adriana por todo su afecto y preocupación.
A mis amigos del 4º C, especialmente a Mauricio, Hugo, Nicolás e Ignacio por siempre
estar a mi lado compartiendo los momentos buenos, malos y aventuras.
A mis amigos Makarena, Oscar, Paul, Francis y especialmente a Carmen, Marcos,
Mauro, Naty, Carlos y Anita por siempre estar a mi lado acompañando y apoyándome
en esta etapa importante de mi vida.
A mis amigas del laboratorio Masiel, Paty, Lorena, Lizethly y a ti Alejandra por hacer
tan grata y entretenida mi estadía en este.
Al profesor Edwar Fuentes por la confianza depositada en mí al permitirme trabajar con
él en el laboratorio y por su buena disposición, paciencia, enseñanzas y preocupación
a lo largo de mi trabajo.
A mí, por nunca permitirme caer y no pararme, ni tampoco abandonar mis sueños e
ideales.
Todos(as) ustedes tienen un rinconcito, quizás distinto, pero importante en mi
corazón……

4
Los autores agradecen el financiamiento otorgado por Fondecyt
Proyecto 11060461

5
RESUMEN
El aceite de oliva es un aceite natural que constituye una pieza fundamental de la dieta
mediterránea. Se caracteriza por sus propiedades nutricionales y efectos saludables,
debido a su alto contenido de antioxidantes y ácidos grasos monoinsaturados. Es por
esto que su consumo se ha masificado a lo largo del mundo y por lo tanto su
producción se ha ido incrementando estos últimos años.
Para asegurar la producción y la calidad de este aceite, habitualmente se utilizan
plaguicidas que evitan daños al olivo y sus frutos producidos por diferentes plagas.
Entre los plaguicidas más ampliamente utilizados en olivos se encuentran los
organofosforados, los que debido a sus efectos dañinos para la salud están sujetos a
normas que regulen la presencia de sus residuos en los alimentos. A su vez, se
requiere de métodos analíticos adecuados en términos de selectividad y sensibilidad
para verificar la presencia de plaguicidas en aceites.
En este trabajo se desarrolló un método analítico para la extracción y determinación de
residuos de Dimetoato, Diazinón, Metilparatión, Metilpirimifos, Malatión, Fentión,
Clorpirifos, Metidatión y Metilazinfos en matrices de aceite de oliva y palta mediante el
uso de la extracción asistida por microondas a presión atmosférica, limpieza con
extracción en fase sólida y cromatografía de gases con detector fotométrico de llama
(GC-FPD). Luego de desarrollar un método cromatográfico que lograra una correcta
identificación y cuantificación de los compuestos, se procedió a confeccionar un
aparato de extracción que permitiera la extracción de los compuestos de interés desde
el aceite, por partición con acetonitrilo, evitando la evaporación de este último durante
el proceso. Este aparato consta de un matraz erlenmayer de 50 mL acoplado con un
refrigerante enfríado por aire. En el siguiente paso se realizó un screening mediante un

6
diseño factorial fraccionado 25-1
para conocer los factores que afectan
significativamente la eficiencia de extracción. Potencia, tiempo y volumen de
extractante fueron los factores que posteriormente se optimizaron mediante un diseño
Doehlert, dejando la dilución del aceite con hexano (1:1) como factor fijo. Las
condiciones óptimas de extracción resultaron ser: 150 W de potencia, 13 min y 15 mL
de acetonitrilo lográndose con estas condiciones recuperaciones entre 80 y 103% para
una concentración de 0,025 μg g-1
.
Luego se estudió la limpieza de los extractos, probando dos fases de extracción en
fase sólida SPE (carbón grafitizado y C18) y el tipo de solvente de elución (metanol y
acetonitrilo). Finalmente los mejores resultados (menor cantidad de aceite coextraído)
se obtuvieron para la columna C18 y elución con 5 mL de acetonitrilo, el aceite
coextraído fue de 3 mg g-1
aproximadamente.
Una vez optimizado, el método se validó determinando sus parámetros de calidad
analítica, la linealidad fue evaluada en el intervalo de 0,004 - 0,015 µg g-1
(0,008 a
0,320 para M. Azinfos), obteniéndose valores de r entre 0,997 y 0,999. Su sensibilidad
analítica se encuentra entre 0,002 y 0,003 µg g-1
, su mLOQ está entre 0,004 -0,015 µg
g-1
y su precisión se encuentra entre 4 y 8 % de DER. Finalmente el método fue
aplicado al análisis de muestras reales obtenidas en el comercio obteniéndose un 50 %
de las muestras analizadas positivas en Clorpirifos, 27 % en residuos de Diazinón, 15
% en Metidatión y 4 % en Metilparatión, no encontrándose en ninguno de ellos
concentraciones de Metidatión superiores al límite máximo de residuos en aceite de
oliva (único compuesto con un valor reportado en este alimento). Por otra parte en una
de las cuatro muestras de aceite de palta analizadas se detectó Clorpirifos.

7
ABSTRACT
“OPTIMIZATION OF THE MICROWAVE-ASSISTED EXTRACTION FOR THE
DETERMINATION OF PESTICIDES IN OLIVE AND AVOVADO OIL”
The olive oil is natural oil that constitutes a fundamental piece of the Mediterranean
diet. This food is characterized by his nutritional properties and healthy effects, which
are due to a high content of antioxidant and mono-unsaturated fatty acids.
Consequently his consumption has been increased along the world and therefore his
production has been increasing the latter years.
To assure the production and the quality of this oil, pesticides are commonly used to
avoid the damages to the olive tree and their fruits produced by different plagues.
Organophosphorus pesticides are the compounds more widely used for the pest control
in olive trees and are subject to norms that regulate his presence in food due to the
harmful effects to health. In turn, analytical methods adapted in terms of selectivity and
sensibility is needed to check the presence of pesticides in oil.
In this work was developed an analytical method for the extraction and determination of
residues of Dimethoate, Diazinon, Parathion Methyl, Pirimiphos Methyl, Malathion,
Fenthion, Chlorpyiriphos, Methidathion and Azinphos Methyl in olive and avocado oil by
means of atmospheric pressure microwave-assisted extraction, cleanup with solid
phase extraction and gas chromatography with flame photometric detector (GC-FPD).
Once a chromatographic method was developed for achieving a correct identification
and quantification of the compounds, it was devised an extraction system to extract the
compounds of interest from the oil through partition with acetonitrile, avoiding the
evaporation of the solvent during the process. This device consists of an Erlenmeyer
flask of 50 mL connected to an air-cooling condenser. In the following step a screening
through a fractional factorial design 2 5-1
was performed to know the factors that affect

8
significantly the extraction efficiency. Power, time and volume of extracting solvent were
the factors optimized by means of a Doehlert design, leaving the dilution of the oil with
hexane (1:1) as fixed factor. The optimal conditions of extraction were: 150 W of power,
13 min and 15 mL of acetonitrile. Under these conditions the recoveries ranged 80 to
103 % for a concentration of 0.025 µg g-1
.
Then the cleanup of the extracts was performed through solid phase extraction
considering two different phases (grafitized carbon black and C18) and the type of
solvent for the elution (methanol and acetonitrile). Finally the best results (minor
quantity of co-extracted oil) were obtained for the column C18 and elution with 5 mL of
acetonitrile (the co-extracted oil was approximately 3 mg g-1
).
Once optimized, the method was validated determining the analytical characteristic.
The linearity was evaluated in the interval of 0.004 – 0.015 µg g-1
(0.008 to 0.320 for
Azinphos Methyl) obtaining r values between 0.997 and 0.999. The analytical sensitivity
ranged 0.002 to 0.003 µg g-1
, mLOQ was comprised between 0.004-0.015 µg g-1
and
the precision ranged 4 to 8 % of RSD. Finally the method was applied to the analysis of
real samples purchased in local market. 50 % of the analyzed samples contained
Chlorpyriphos, 27 % Diazinon, 15 % Methidathion and 4 % parathion methyl. None of
the analyzed samples shown concentrations of Methidathion higher than the maximum
limit of residues in olive oil (the only composed with a reported value in this food). On
the other hand, in one of four samples of avocado oil analyzed it was detected
Chlorpyriphos.

9
ÍNDICE GENERAL
RESUMEN IV
ABSTRACT VI
ÍNDICE GENERAL VIII
ÍNDICE DE TABLAS X
ÍNDICE DE FIGURAS XI
Pág.
1. INTRODUCCIÓN 1
2. OBJETIVOS 8
2.1.Objetivos Generales 8
2.2.Objetivos Específicos 8
3. HIPÓTESIS. 9
4. MATERIALES Y MÉTODOS. 10
4.1.- Reactivos, Materiales, Equipos y Softwares 10
4.1.1. Reactivos 10
4.1.2. Materiales 11
4.1.3. Equipos 11
4.1.4. Softwares 12
4.2.- Soluciones 12
4.3.- Aceites analizados 12
4.4.- Métodos 14
4.4.1. Análisis Cromatográfico 14
4.4.2. Procedimiento de Fortificado 15
4.5.- Extracción Asistida por Microondas 16
4.5.1. Experimentos Previos 16
4.5.2. Diseño Exploratorio Multivariado 18

10
4.5.3. Optimización de la Extracción 21
4.6.- Clean-up Mediante Extracción en Fase Sólida 24
4.7.- Validación del Método Propuesto 24
4.7.1. Determinación de Linealidad, Sensibilidad Analítica, y Límite
de Cuantificación a Partir de la Recta de Calibración 26
4.7.2. Determinación de la Recuperación, la Precisión y el Límite
de Cuantificación del Método 26
4.8.- Análisis Aceite de Palta 27
4.9.- Comparación con Método de Referencia 27
4.10.- Aplicación a Muestras Reales 28
4.11.- Ensayo Confirmatorio 28
5. RESULTADOS Y DISCUSIÓN. 29
5.1.- Método Cromatográfico 29
5.2.- Extracción Asistida por Microondas 31
5.2.1. Experimentos Previos 31
5.2.2. Diseño Exploratorio Multivariado 35
5.2.3. Optimización 42
5.3.- Limpieza de los Extractos 49
5.4.- Validación del Método Propuesto 50
5.5.- Análisis Aceite de Palta 54
5.6.- Comparación con Método de Referencia 55
5.7.- Aplicación a Muestras Reales 56
5.8.- Ensayos Confirmatorios 58
6. CONCLUSIONES. 60
7. BIBLIOGRAFÍA. 62
ANEXOS 66

11
ÍNDICE DE TABLAS
Pág.
Tabla 1 Marca, región y valle de origen de los aceites analizados 13
Tabla 2 Codificación de los factores experimentales screening 19
Tabla 3 Diseño factorial fraccionado (25-1
) 20
Tabla 4 Matriz, factores experimentales y niveles del diseño Doehlert 22
Tabla 5 Tiempos de retención con el programa de temperatura óptimo 29
Tabla 6 Programa de temperatura para la separación de los 9 OPPs 30
Tabla 7 Recuperaciones obtenidas a distintas potencias de microondas 31
Tabla 8 Recuperaciones para extracción a 300 W en una y dos etapas 32
Tabla 9 Recuperaciones usando 10 mL de AcN y diluyendo con n-hexano 33
Tabla 10 Recuperaciones para extracción usando refrigerante 34
Tabla 11 Matriz de respuesta, % de recuperación, deseabilidad y aceite
coextraído para diseño factorial fraccionado (25-1
) 36
Tabla 12 ANOVA para el screening de la etapa de extracción 37
Tabla 13 ANOVA para la optimización de la etapa de extracción 42
Tabla 14 Matriz de respuesta, % de recuperación, deseabilidad y aceite
coextraído para diseño Doehlert de optimización 43
Tabla 15 Resultado de la optimización 47
Tabla 16 Comparación entre los valores óptimos experimentales y predichos 48
Tabla 17 Aceite coextraído y recuperación diferentes métodos de limpieza 49
Tabla 18 Parámetros de calidad analítica del método 52
Tabla 19 Porcentajes de recuperación para tres diferentes concentraciones 53
Tabla 20 Resultados de extracción en aceite de palta 54
Tabla 21 Resultados comparación con método de referencia 55
Tabla 22 Resultados análisis de muestras reales 57

12
ÍNDICE DE FIGURAS
Pág.
Figura 1 Sistema de extracción 17
Figura 2 Diagrama método extracción 25
Figura 3 Cromatograma GC-FPD de los nueve plaguicidas 30
Figura 4 Diagramas de Pareto para screening 38
Figura 5 Diagrama de Pareto para la función de conveniencia del Screening 41
Figura 6 Gráficos de interacciones 41
Figura 7 Gráfico de residuos 44
Figura 8 Diagrama de Pareto función de conveniencia optimización 45
Figura 9 Superficies de respuesta individuales 9 OPPs optimización 46
Figura 10 Superficie de respuesta función de conveniencia global 47
Figura 11 Cromatogramas obtenidos en GC-MS-MS 59

13
1. INTRODUCCIÓN
El aceite de oliva es un aceite natural que ha sido producido durante miles de años por
los países de la cuenca del mar Mediterráneo (España, Portugal, Grecia, Italia,
Turquía, Túnez y Marruecos). Este aceite se obtiene directamente de los olivos (Olea
Europaea), un cultivo tradicional de esta cuenca, el que ha contribuído desde tiempos
antiguos a la economía, la salud y la alimentación de los habitantes del Mediterráneo.
Entre las ventajas que posee, y que han hecho que se convierta en el principal
ingrediente de la dieta mediterránea, se encuentran sus propiedades nutricionales y
efectos saludables debido a su alto contenido de antioxidantes y ácidos grasos
monoinsaturados (Fuentes et al, 2008; Garrido-Frenich et al, 2007), también se ha
demostrado su protección contra el cáncer y las enfermedades coronarias (Garcés-
García et al, 2006). Este producto tiene una gran importancia en la economía
sustentable de importantes regiones de España, Grecia e Italia; países que son los
principales productores de aceite de oliva en el mundo (García-Reyes et al, 2007).
El aceite de oliva virgen se obtiene del fruto del olivo exclusivamente por
medios mecánicos y/o físicos bajo condiciones particularmente térmicas que no
producen la alteración de la calidad del aceite de oliva (Lentza-Rizos et al (a), 2001) el
cual no está sometido a otro tratamiento que el lavado, la decantación, la
centrifugación y la filtración. El aceite de oliva está compuesto principalmente por
triacilgliceroles (aprox 99%) seguido por ácidos grasos libres, mono y diacilgliceroles y
una variedad de otros compuestos tales como esteroles, alcoholes alifáticos,
tocoferoles y pigmentos. También están presentes compuestos fenólicos y volátiles
(Boskou et al, 2006). El aceite de oliva se puede distinguir entre un aceite de oliva
virgen y aceites de oliva provenientes de tratamientos posteriores de refinamiento
mediante algunos parámetros de calidad, los que dependen del organismo
internacional que los clasifique (IOOC, Codex Alimentarius, EC), los parámetros

14
comunes a todas estas organizaciones son la determinación de ácidos grasos libres
(acidez libre), el índice de peróxido, espectrofotometría de absorbancia en la región
UV, características organolépticas y solventes halogenados. El criterio más usado es el
de la determinación de ácidos grasos libres, según el cual los aceites se clasifican en:
aceite de oliva extravirgen (acidez inferior a 0,8%), aceite de oliva virgen (hasta 2% de
acidez), aceite de oliva virgen corriente (hasta 3,3 % de acidez), aceite de oliva virgen
lampante (sobre 3,3 % de acidez) y aceite de oliva refinado (procedente de una
refinación por procedimientos químicos de aceites de oliva virgen de alta acidez)
habiendo perdido este aceite sus características organolépticas y sus propiedades
naturales. El aceite de oliva extravirgen es el de mayor calidad y presenta un sabor y
un aroma excepcional. Tanto el aceite de oliva virgen como el extravirgen son ricos en
vitaminas, ácidos grasos (oleico, palmítico, esteárico, linoleico, etc…), polifenoles,
entre otros compuestos de naturaleza antioxidante que ayudan a la prevención de
enfermedades degenerativas y actúan contra el envejecimiento (Quiñones, 2008).
Las características positivas mencionadas anteriormente del aceite de oliva
han aumentado la demanda por este producto a través del mundo, de hecho, la Unión
Europea (UE) es líder en la producción mundial de aceite de oliva (75 %) y a la vez el
principal consumidor de este mismo (68%), aunque el interés ha ido creciendo en otros
países (Garrido-Frenich et al, 2007; International Olive Oil Council, Nov 2008).
En nuestro país la industria olivícola nacional comenzó a mediados del siglo
pasado pero fue en la década de los 90 cuando se dió paso a fuertes inversiones en el
sector y se realizaron las primeras exportaciones. Una de las ventajas que posee Chile
para la producción de aceite de oliva es que posee un grupo de microclimas que
presenta condiciones similares de temperatura y humedad a la cuenca del
Mediterráneo. Estas temporadas muy marcadas de lluvia en invierno y sol en verano
impiden que las precipitaciones afecten la maduración de la fruta, pero entregan el
agua necesaria para el desarrollo de la misma. La ubicación de las plantaciones en
nuestro país, entre el valle del Copiapó por el norte y el río Bío-Bío por el sur, aseguran
el nivel de radiación solar necesario para que la fruta complete el proceso de
maduración. Y si además tenemos en cuenta la oscilación térmica entre el día y la
noche que favorece la concentración de compuestos aromáticos y el efecto moderador

15
del clima de la costa podemos concluir que nuestro país cuenta con condiciones
particularmente favorables para el cultivo del olivo (Chileoliva, 2009).
Otro aceite de reciente surgimiento en el país y con buenas perspectivas a
futuro es el aceite de palta, el que inició su producción en nuestro país hacia el año
2004. Este aceite se produce a través de una variedad de palta de calidad premium: la
Hass. Esta variedad ha sido elegida por su calidad y por la cantidad de aceite que
brinda su pulpa (un 30 %).
Su proceso de elaboración comienza con una extracción en frío, seguido
por una etapa de decantación y para terminar, la conservación en cubas de acero con
purga de nitrógeno para eliminar el oxígeno.
Entre los beneficios para la salud que proporciona el aceite de palta
extravirgen podemos mencionar que se encuentra libre de colesterol y de ácidos
grasos trans, también posee un alto contenido de ácidos grasos monoinsaturados
(principalmente ácido oleico) y también un alto nivel de antioxidantes (vitamina E) y
fitoesteroles. Todas estas características lo convierten en un ingrediente ideal para una
dieta saludable. No podemos dejar de mencionar que sus características sensoriales
lo hacen un ingrediente ideal para fines gastronómicos (Hass, 2009; Avocadooilchile,
2009)
Actualmente nuestro país posee cerca de 22 mil hectáreas de olivo
plantadas de las cuales 13 mil producen sólo aceite de oliva extravirgen. La producción
nacional de aceite de oliva fue de 8500 toneladas el año 2008, de las cuales el 86 % se
destinaron al mercado interno y el resto a exportaciones, las que se destinan
mayoritariamente hacia Venezuela, EE.UU., España y Brasil. En cuanto a las paltas,
Chile tiene actualmente una superficie plantada por sobre las 33 mil hectáreas, siendo
el segundo país con mayor superficie plantada de este frutal a nivel mundial, de las
cuales la variedad Hass corresponde a un 85 % de la superficie total. El año 2008 se
produjeron 260 mil toneladas de este fruto, de las cuales 185 mil se destinaron a
exportación siendo el principal destino EE.UU., seguido por Europa. (Iglesias, 2009;
Bravo 2009)
Para producir un aceite de gran calidad el fruto debe estar protegido contra
varias pestes, como la mosca del olivo Bactocera (Dacus) oleae, la cual es la principal

16
peste de los olivos en Europa (Cabras et al (a), 1997) puesto que las hembras ponen
sus huevos en la aceituna, dejando así el fruto marcado. En nuestro país las plagas
más importantes de los olivos son: la Conchuela negra del olivo (Saissetia oleae), la
Conchuela móvil del olivo (Orthezia olivícola) y la escama blanca de la hiedra
(Aspidiotus hederae) (Prado et al, 2003). Por lo tanto los olivos deben recibir
tratamiento con varios pesticidas, entre los más ampliamente usados se encuentran los
pesticidas organofosforados (Rastrelli et al, 2002; Tsoutsi et al, 2006) ya que entre sus
ventajas se encuentran su relativamente bajo costo, su amplio espectro de actividad y
su alta eficiencia en insectos (Li-Li et al, 2007). Los pesticidas organofosforados son
inhibidores irreversibles de la enzima acetilcolinesterasa (encargada de las
transmisiones neurológicas de insectos y mamíferos) (Mastrantonio et al, 2008). Estos
pesticidas pueden persistir a la cosecha, haciendo posible la contaminación del aceite
de oliva, ya que son usados en grandes cantidades en los cultivos de olivos (Dugo et
al, 2005). La presencia de residuos de pesticidas en olivos y aceite de oliva pueden
afectar negativamente la salud humana, en el caso de los organofosforados
investigaciones recientes los relacionan con enfermedades como cáncer y Parkinson
(Alavanja et al, 2004).También es importante destacar que se espera que los residuos
de los pesticidas organofosforados por su carácter lipofílico se concentren y estabilicen
por largos períodos (Cabras et al (b), 1997) en el aceite de oliva ya que de cinco
kilogramos de olivos se obtiene un kilogramo de aceite de oliva (Amvrazi et al, 2006;
Cabras et al (a), 1997) por lo tanto la concentración de residuos en el aceite será
consecuentemente mayor que en los frutos. Por lo anterior se puede definir como uno
de los criterios más importantes de calidad la baja concentración o no detección de
residuos de pesticidas en los aceites de oliva (Lentza-Rizos et al (a), 2001).
Es por esta razón que existen diferentes regulaciones que establecen límites
máximos de residuos de pesticidas (MRLs por sus siglas en inglés) en olivos y aceites
de oliva las cuales han sido establecidas por la Unión Europea y la Comisión del Codex
Alimentarius de la Organización de Agricultura y Alimentos de las Naciones Unidas
(FAO) (Hiskia et al, 2008). Por lo tanto se hace necesario el contar con métodos de
control rápidos y confiables para asegurar que los niveles de residuos en aceite de
oliva se encuentran bajo los MRLs permitidos por las organizaciones citadas
anteriormente. Sin embargo la diversidad de propiedades fisicoquímicas de los

17
pesticidas y la complejidad de la matriz dificultan el desarrollo de metodologías que
cubran todos los analitos posibles de encontrar, siendo necesario una continua
investigación con el fin de desarrollar metodologías analíticas cada vez mas sensibles,
selectivas y rápidas que se puedan utilizar en laboratorios donde se realicen análisis de
rutina para asegurar la calidad de los aceites de oliva.
Una de las etapas más importantes en un método analítico es la extracción de
los analitos desde la matriz. Aquí se deben considerar la polaridad del analito, su
volatilidad, su pKa y la solubilidad en agua (García et al, 2006). También es importante
la composición de la matriz, especialmente si se trata de matrices grasas, a saber,
productos con contenido de grasa sobre el 2% son considerados grasos (Ahmed et al,
2001). Los problemas analíticos asociados con el análisis de pesticidas en estas
matrices grasas son bien conocidos, especialmente cuando se trabaja con
cromatografía de gases. De este modo la preparación de la muestra es un paso clave
en el procedimiento analítico porque aún cantidades pequeñas de lípidos pueden dañar
columnas, detectores y causar modificación de la señal cromatográfica (Ferrer et al,
2005; Brun et al, 2005). Por lo tanto la determinación de pesticidas en aceite de oliva,
que es el aceite vegetal mas difícil de analizar debido a su gran cantidad de lípidos
(Yagüe et al, 2005; Tsatsakis et al, 2003), requiere un método de extracción adecuado
y un proceso de limpieza efectivo para remover parcial o totalmente los lípidos
coextraídos junto con los compuestos de interés, esto permite un incremento en la
selectividad, reduce el mantenimiento del sistema cromatográfico y aumenta la
confiabilidad de los resultados (Garrido-Frenich et al, 2007; Fernández et al, 2006). Es
por esto que se han desarrollado varios métodos multiresiduos para el análisis de
residuos de pesticidas organofosforados en aceite de oliva. Estos métodos
generalmente se basan en extracción líquido-líquido, sólido-líquido y cromatografía de
permeación en gel (GPC), seguido de la limpieza y finalmente la determinación
cromatográfica. Los procedimientos de extracción líquido-líquido descritos en la
literatura están basados en la partición entre aceite y acetonitrilo. Rizos y Avramides
desarrollaron un procedimiento para extraer pesticidas desde aceite de oliva por
partición entre la matriz solubilizada en acetonitrilo saturado en hexano y extracción
con hexano saturado en acetonitrilo. Esta extracción provee altos rendimientos de
extracción para pesticidas polares con baja solubilidad en la matriz grasa, pero no es

18
muy efectivo para pesticidas mas apolares que son solubilizados en la matriz (Barrek et
al, 2003), además es un procedimiento que usa grandes cantidades de solventes
potencialmente peligrosos y un trabajo manual que consume mucho tiempo. La
extracción sólido-líquido mas usada es la extracción en fase sólida (SPE), esta emplea
sorbentes tales como octadecilsilano (C18), Florisil, carbón grafitizado, alúmina y sílica
gel.
La GPC, en la cual las moléculas son separadas de acuerdo a su tamaño
es a menudo aplicada para la limpieza de extractos grasos. La ventaja de este
procedimiento es que posee un alto grado de automatización pero es lenta costosa y
requiere grandes cantidades de solventes orgánicos (Cunha et al, 2007).
Los métodos de limpieza se basan en los mismos principios que la
extracción y por lo tanto se ocupan los mismos procedimientos (L-L, SPE, GPC)
además de otros métodos en los que se realiza la extracción y la limpieza en una sola
etapa tales como dispersión de matriz en fase sólida (MSPD), microextracción en fase
sólida (SPME) o extracción con fluídos supercríticos (SFE) (Sánchez et al 2004; Díaz-
Plaza et al, 2007; Hernando et al, 2007).Otros autores han analizado aceite de oliva sin
limpieza o utilizando limpieza por precipitación de los lípidos coextraídos a baja
temperatura (Yagüe et al, 2005).
Para la determinación de residuos de pesticidas la mayoría de los métodos
usados están basados en análisis de HPLC o GC. La técnica escogida para la
detección y cuantificación de residuos de pesticidas en aceite de oliva es la
cromatografía de gases (GC), debido al desarrollo de detectores específicos y
elemento-selectivos y al reemplazo de las columnas empacadas por columnas
capilares, lo que a su vez ha aumentado la eficiencia de separación. Es por esto que la
GC se ha transformado en una herramienta analítica muy poderosa para el análisis de
pesticidas, siendo HPLC requerida cuando se trabaja con pesticidas termolábiles o
muy poco volátiles. (Guardia-Rubio et al, 2006). Entre los detectores selectivos que se
utilizan en GC se encuentran Nitrógeno-Fósforo (NPD), fotométrico de llama (FPD),
captura electrónica (EC) y espectrométrico de masa (MS). En los últimos años el
tándem MS (MS/MS) se ha convertido en una mejor elección para análisis de residuos
de pesticidas debido a su mayor selectividad y sensibilidad (García et al, 2006; Vreuls
et al, 1996), siendo obligatorio para obtener una identificación sin ambigüedades

19
(Fuentes et al, 2008). Más recientemente se han usado los analizadores de masa ion-
trap y triple cuadrúpolo (QqQ), siendo este último usado para determinar residuos de
pesticidas multiclase en aceite de oliva debido a sus altas velocidades de adquisición y
selectividad. Sin embargo, la necesidad práctica para un control de pesticidas
adecuado está principalmente enfocado en métodos de tratamiento de muestras
simples y rápidos que puedan ser fácilmente implementados en laboratorios de rutina.
Otro método de extracción que ha atraído creciente interés en los últimos
años es la extracción asistida por microondas (MAE), la que consiste en la extracción
de los analitos desde la muestra hacia un extractante líquido usando la energía
microondas como fuente de energía. Esta partición de los analitos depende de la
temperatura y de la naturaleza del extractante, el cual debe tener una alta constante
dieléctrica para absorber la energía microondas eficientemente, entre las ventajas de la
MAE se cuentan el requerimiento de bajas temperaturas, eficiencia de extracción
comparable con métodos convencionales y la posibilidad de extraer simultáneamente
varias muestras al mismo tiempo (alta frecuencia de análisis (throughput)) esto último
cobra importancia al compararlos con los métodos convencionales de extracción tales
como la extracción con agitación mecánica. Además MAE ofrece una gran reducción
de consumo de tiempo y de solvente. (Camel et al, 2000; Gilbert-López et al, 2009;
Lambropoulou et al, 2007).
En el presente trabajo se propone un sistema de extracción asistida por
microondas en sistema abierto para la extracción de residuos de nueve pesticidas
organofosforados que son utilizados habitualmente en el cultivo del olivo: dimetoato,
diazinón, metilparatión, metilpirimifos, malatión, fentión, clorpirifos, metidatión y
metilazinfos (Anexo 3; Rastrelli et al, 2002; Hiskia et al, 2008) seguida por una etapa de
limpieza (“clean up”) mediante SPE y finalmente utilizando GC-FPD como método de
detección.
La optimización de la extracción fue llevada a cabo mediante diseño de
experimentos y utilizando una función de conveniencia para evaluar en forma conjunta
las diferentes respuestas generadas por los compuestos de interés.
El método desarrollado fue validado y finalmente aplicado al análisis de
20 aceites de oliva y 4 aceites de palta de estantería chilena.

20
2. OBJETIVOS
2.1. OBJETIVO GENERAL
Desarrollar un método analítico eficiente para determinar plaguicidas organofosforados
en aceites de oliva y palta, basado en extracción asistida por microondas, purificación
de extractos por diferentes medios y cromatografía de gases como técnica de
cuantificación final.
2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS
• Optimizar la extracción asistida por microondas con reparto líquido-líquido de
plaguicidas organofosforados seleccionados desde aceites de oliva y palta.
• Evaluar diferentes métodos para eliminar el aceite coextraído desde los
extractos, incluyendo extracción sólido-líquido con distintas fases adsorbentes o
precipitación por disminución de temperatura.
• Utilizar métodos estadísticos y quimiométricos para estudiar el efecto de
diferentes factores que afecten la extracción de los plaguicidas desde aceites
vegetales y la eficiencia en la limpieza de los extractos.
• Validar el método propuesto y aplicarlo en el análisis de muestras reales de
aceites de oliva y palta chilenos.

21
3. HIPÓTESIS
1. Es posible realizar la extracción líquido-líquido con la asistencia de microondas,
de plaguicidas organofosforados desde aceite de oliva y palta para su posterior
determinación mediante métodos cromatográficos.
2. Los aceites de oliva y palta producidos en Chile presentan niveles residuales de
plaguicidas organofosforados de uso habitual en el país.

22
4. MATERIALES Y MÉTODOS
4.1. REACTIVOS, MATERIALES, EQUIPOS Y SOFTWARES
4.1.1. Reactivos
• Acetonitrilo Grado HPLC, Fischer Scientific.
• Acetona Grado Pesticida, Fischer Scientific.
• Hexano Grado Pesticida, Fischer Scientific.
• Diclorometano Optima, Fischer Scientific.
• Agua calidad Nanopure.
• Aire Sintético Instrumental 21 ± 2% O2 + N2, AGA.
• Helio Extrapuro 99,995 % de pureza (H2O < 2 ppm O2 < 5 ppm), AGA
• Hidrógeno 99,995 % de pureza (H2O < 5ppm O2 < 7 ppm), AGA
• Nitrógeno Extrapuro 99,995 % de pureza (H2O < 3 ppm O2 < 9 ppm),AGA
• Trifenilfosfato (TFF) 99% de pureza, Aldrich.
• Clorpirifos (98% de pureza), Chem Service.
• Diazinón (99% de pureza), Chem Service.
• Dimetoato (99,1% de pureza), Chem Service.
• Malatión (98% de pureza), Chem Service.
• Fentión (98% de pureza), Chem Service.
• Metidatión (98% de pureza), Chem Service.
• Metilazinfos (99% de pureza), Chem Service.
• Metilparatión (98% de pureza), Chem Service.
• Metilpirimifos (99% de pureza), Chem Service.

23
4.1.2. Materiales
• Material de vidrio de uso general y volumétrico clase A.
• Micropipeta de desplazamiento de aire 20-100 μL, Transferpette.
• Micropipeta de desplazamiento de aire 100-1000 μL, Labopette.
• Columnas SPE Supelclean Envi-carb, Supelco.
• Columnas SPE Supelclean LC-18, Supelco.
• Viales de vidrio ámbar (15 mL) tapa rosca y contratapa de teflón.
• Jeringa de Vidrio (10 μL), Hamilton.
4.1.3. Equipos
• Cromatógrafo de gases Hewlett-Packard (HP) 5890 Series II, equipado con un
detector fotométrico de llama (FPD) y un puerto de inyección split/splitless.
• Columna capilar HP-5 (30 m x 0,25 mm i.d., 0,25 μm film) 5% fenil-polidimetil
siloxano, Agilent.
• Interfaz 35900E, Agilent.
• Microondas Milestone MLS-1200 MEGA, equipado con rotor de polipropileno y
vasos de Tetrafluormethaxil (TMF).
• Evaporador rotatorio WB 2000, Heidolph
• Balanza Analítica 40SM-200AS (± 0,001 g), Precisa.
• Balanza de Precisión 4000C (± 0,00001 g), Precisa.

24
4.1.4. Softwares
• Software para la adquisición y el procesamiento de datos ChemStation, Agilent.
• Software de procesamiento de datos Statgraphics Centurion XV
• Origin
• Microsoft office Excel 2007
4.2. SOLUCIONES
• Se prepararon soluciones stock de los nueve compuestos por separado a partir
de los estándares puros, con este fin se masaron: 13,01mg; 10,05mg; 12,56mg;
12,56mg; 12,10mg; 11,09mg; 10,20mg; 11,36mg; 12,62mg; 14,41mg de
dimetoato, diazinón, metilparatión, metilpirimifos, malatión, fentión, clorpirifos,
metidatión y metilazinfos respectivamente, llevándose a un matraz de aforo de
10 mL y enrasando con n-hexano, exceptuando dimetoato y metilazinfos los
cuales fueron disueltos en acetona. A partir de estas soluciones se obtuvieron
las soluciones de trabajo con las cuales se fortificaron los aceites, se
prepararon los patrones en matriz y los patrones para las curvas de calibrado.
• Se preparó una solución de 1000 mg mL-1
de TFF para ser usado como
estándar interno en las mediciones cromatográficas. Para esto se masaron
26,10 mg de una solución estándar de este compuesto y se llevó a un volumen
de 25 mL con acetona.
4.3. ACEITES ANALIZADOS
Con el fin de poner a prueba el método propuesto con muestras reales se
analizaron 22 aceites de oliva (20 nacionales y 2 españoles) y 4 aceites de palta,
disponibles en el mercado en el momento del análisis. También se usó un aceite
de oliva Extra Virgen Orgánico para pruebas de recuperación. En la tabla 1 se
enumeran los aceites usados y su origen.

25
Tabla 1 Marca, región y valle de origen de los aceites analizados
Aceite de Oliva Extra Virgen Región Valle
Olioliva III Valle de Copiapó
Mestre IV Valle del Limarí
Razeto V Valle del Aconcagua
La Crianza R.M. Valle de Aculeo
Sol de Aculeo R.M. Valle de Aculeo
Montecristo R.M. Valle del Maipo
Olave R.M. Valle del Maipo
Terra Santa R.M. Valle de Curacaví
Kardamili Frantoio VI Valle del Cachapoal
Kardamili Clásico VI Valle del Cachapoal
Kardamili Arbequina VI Valle del Cachapoal
Casta VII Valle de Curicó
1492 VII Valle del Maule
Canepa VII Valle de Curicó
Petralia VII Valle de Curicó
Las Doscientas VII Valle del Maule
El Cerrito VII Valle del Maule
Oveja Negra VII Valle del Maule
Oro Maule VII Valle del Maule
Aresti VII Valle del Maule
Carbonell Andalucía, España
Borges Tárrega, España
Aceite de Palta Extra Virgen
Alwe V Valle del Aconcagua
Del Palto R.M. Valle del Maipo
Lamay R.M. Valle del Maipo
Razeto V Valle del Aconcagua

26
4.4. MÉTODOS
4.4.1. Análisis Cromatográfico
• Determinación del Orden de Elución de los Plaguicidas
A partir de la solución stock de cada uno de los nueve plaguicidas (Dimetoato,
Diazinón, Metilparatión, Metilpirimifos, Malatión, Fentión, Clorpirifos, Metidatión
Metilazinfos), se prepararon las correspondientes soluciones de 0,1 µg mL-1
en hexano
para determinar el tiempo de retención de los compuestos. El volumen de inyección fue
de 1 μL. Para estas mediciones en GC-FPD se utilizó el inyector y el detector a 250 y
280º C respectivamente, el flujo de Helio (gas portador) en la columna fue de 0,95 mL
min-1
, para Hidrógeno fue de 75 mL min-1
y el flujo de aire fue de 100 mL min-1
. Se
utilizó un programa de temperatura no optimizado: 70ºC, por 2 min; aumento de
temperatura a razón de 40º/min hasta 230ºC; manteniendo la temperatura por 1 min;
aumento de temperatura a razón de 5ºC/min hasta 280ºC, manteniéndola por 1 min.
• Separación Cromatográfica de los Nueve Compuestos
Se preparó una solución de los nueve pesticidas en hexano con una concentración de
cada uno de 0,5 μg mL-1
y como patrón interno se utilizó TFF 0,1 μg mL-1
. Se inyectó 1
μL de está solución con distintos programas de temperatura hasta obtener una buena
separación de los 9 compuestos, obteniéndose de este modo el programa de
temperatura adecuado para lograr una buena resolución de las señales. El programa
de temperatura optimizado fue el siguiente: 70 ºC por 2 min; aumento de temperatura a
razón de 30 ºC/min hasta 180 ºC, mantención por 18 min; aumento de temperatura a
25 ºC/min hasta 280º C, manteniendo finalmente por 4 min.
• Pruebas Confirmatorias con GC-QqQ-MS/MS
Con el fin de confirmar la presencia de los plaguicidas en las muestras reales, se
recurrió a la cromatografía de gases (GC) acoplada con masa (MS), para realizar
igualmente su análisis

27
El equipo utilizado fue un cromatógrafo de gases Varian CP-3800 equipado con
control de flujo electrónico. Las muestras fueron inyectadas con un autosampler CP-
8400 en un puerto de inyección con temperatura programable split/splitless, operado
en el modo split. El cromatógrafo de gases está unido a un analizador de masa triple
cuadrupolo (QqQ) Varian 300 MS, usando una fuente de ionización de electrones (IE).
Se usó Argón (99,999 %) como gas de colisión a 2,0 mTorr (1 Torr = 133,322 Pa). Se
inyectaron alícuotas de 2 μL de muestra. La temperatura inicial del inyector fue de
280ºC, mantenida por 1 min para luego aumentar hasta 350ºC a una razón de
200ºC/min, manteniéndose por 15 min. El espectrómetro de masas fue operado en IE
generando electrones con una energía cinética de 70 eV y en modo de adquisición
Selección de Monitoreo de Reacción (SMR). Las temperaturas de línea de
transferencia, fuente de ionización y manifold fueron de: 280, 280 y 40ºC
respectivamente. El tiempo de escaneo fue de 0,25 s. Todos los compuestos fueron
monitoreados en modo de escaneo completo en el rango de m/z 50-550, usando el
modo IE. Luego el ión precursor se seleccionó con el fin de alcanzar un compromiso
entre selectividad y sensitividad. El ión precursor seleccionado fue sometido a
disociación inducida por colisión con Argón, a energías de colisión que varían entre 10
y 40 V. Para cada compuesto se seleccionó un mínimo de dos transiciones MS/MS.
4.4.2. Procedimiento de Fortificado
Para asegurarnos de trabajar con un aceite que no contiene residuos de los pesticidas
que vamos a estudiar, los ensayos de recuperación y optimización se realizaron con un
aceite de oliva extra virgen orgánico adquirido en el mercado, el que además no
contenía señales cromatográficas en FPD asociadas a los compuestos de interés.
El proceso de fortificado es el siguiente: Se agregan 5 mL de una solución de los
nueve pesticidas en hexano de una concentración definida a 50 g de aceite orgánico
extra virgen en un embudo de separación, para obtener el nivel de fortificado deseado.
Luego de la agitación, la muestra se guarda por 24 horas a temperatura ambiente y en
ausencia de luz antes de los ensayos de extracción.

28
4.5. EXTRACCIÓN ASISTIDA POR MICROONDAS (MAE)
4.5.1. Experimentos Previos
• Extracción a Potencias Variables de Microondas
Se masaron 5 ± 0,02 g de aceite de oliva extravirgen orgánico fortificado a dos niveles
(0,1 µg g-1
para dimetoato, diazinón, metilparatión, metilpirimifos, malatión, fentión,
clorpirifos, metidatión y 0,4 µg g-1
para metilazinfos) por cuadruplicado mas un blanco,
en matraces erlenmayer de 50 mL y se les agregó 5 mL de acetonitrilo (extractante) a
cada uno. Luego se les llevó al microondas a potencias variables (200, 300, 400 y 500
W) en un tiempo fijo de 5 min. Luego los extractos se separaron, se llevaron a
sequedad con un evaporador rotatorio (50ºC), luego fueron reconstituidos en 2 mL de
Acetona y guardados en viales a 8 ºC. Para su cuantificación en GC-FPD se ocupó el
método de calibración externa (comparación con un patrón en matriz) y se les agregó a
todos los extractos TFF (patrón interno) 0,1 µg mL-1
. El volumen de inyección fue de 1
μL. Es importante mencionar que el método de cuantificación utilizado aquí fue el que
se utilizó para todas las otras determinaciones de aquí en adelante.
• Experiencias Realizadas a 300 W de Potencia
(0,1 µg g-1
para metilazinfos) por triplicado mas un blanco en
matraces erlenmayer de 50 mL y se les agregó a cada uno 5 mL de AcN y se realizó la

29
extracción a 300 W por 5 minutos. El extracto se cuantificó posteriormente por GC-FPD
por el método antes descrito.
La misma experiencia se llevó a cabo usando 10 mL de acetonitrilo en una sola etapa,
con 10 mL en dos etapas de 5 mL cada una y diluyendo el aceite en 5 mL de n-hexano
extrayéndolo en una etapa con 5 mL de acetonitrilo.
• Extracción Usando un Refrigerante Enfriado por Aire
(0,1 µg g-1
para metilazinfos) por triplicado más un blanco en
matraces erlenmayer de 50 mL, luego se le adicionaron 5 mL de acetonitrilo y se le
acopló un refrigerante enfriado por aire de 13 cm de altura, 2 cm de diámetro y con dos
platos de condensación (figura1). Posteriormente se llevó a cabo la extracción a 300 W
por 5 minutos. Luego de obtenido el extracto se rotaevaporó (50 ºC) y se cuantificó con
GC-FPD.
Figura 1 Sistema de extracción

30
4.5.2. Diseño Exploratorio Multivariado
• Fortificación del Aceite
Se fortificaron 120 g de aceite de oliva extravirgen orgánico con 4 mL de una solución
de concentración 3 μg mL-1
para dimetoato, diazinón, metilparatión, metilpirimifos,
malatión, fentión, clorpirifos, metidatión y 12 μg mL -1
para metilazinfos, para dar una
concentración final en el aceite de 0,1 y 0,4 µg g-1
respectivamente. Con este aceite
fortificado se realizaron las pruebas de screening en su totalidad.
• Diseño de Screening
Con el fin de discernir que factores tienen un efecto significativo sobre la eficiencia de
extracción se evaluaron cinco factores escogidos según conocimientos previos, los
cuales fueron: Porcentaje de Diclorometano (%DCM), Volumen de Acetonitrilo
(Volumen), Potencia de Microondas (Potencia), Tiempo de Extracción (Tiempo) y
Dilución con Hexano (Dilución). La respuesta a evaluar es el rendimiento de la
extracción, expresado en porcentaje de recuperación (% recuperación) para cada
compuesto. El diseño escogido fue un Diseño Factorial Fraccionado a Dos Niveles (25-
1
) con 16 experimentos realizados en dos bloques mas cuatro experimentos
duplicados. En las tablas 2 y 3 se indican los valores de los niveles superior e inferior
para los cinco factores estudiados y la matriz del diseño 25-1
respectivamente.

31
Tabla 2 Codificación de los factores experimentales.
• Análisis Estadístico de los Datos
a) Para evaluar la significancia estadística de los efectos se realizó el test- t de
Student y el test de comparación de varianzas (ANOVA).
b) Para optimizar respuestas múltiples se utilizó la Función de Deseabilidad D de
Derringer. (Anexo 2).
• Procedimiento de extracción
Se masaron 5 g del aceite fortificado en el sistema de extracción escogido, luego se
diluyó con 5 mL de n-hexano (Diluído) cuando correspondía y se le agregó el volumen
de AcN (mL), con una composición en diclorometano (%DCM) dictado por la matriz de
experimentos (los blancos se trabajaron en condiciones intermedias). Luego se
procedió a la extracción en microondas a una potencia (W) e intervalo de tiempo (min)
señalados por la misma para el correspondiente experimento. Luego de la extracción y
de esperar que el sistema retomara la temperatura ambiente se llevó el extracto a un
tubo de centrifuga con la ayuda de una pipeta pasteur, enjuagando el sistema con 2 mL
de AcN y agregándoselos al mencionado tubo. El extracto final se evaporó con la
ayuda de un evaporador rotatorio (50 ºC) y se cuantificó mediante el uso de GC-FPD
en las condiciones de trabajo fijadas anteriormente.
Factor Nivel
Inferior (‐1) Superior (+1)
Diclorometano (%) 0 30
Volumen AcN (mL) 5 10
Potencia (W) 250 400
Tiempo (min) 5 10
Dilución Hexano No Sí

32
Tabla 3 Diseño factorial fraccionado (25-1
) para evaluar el efecto de 5 factores
experimentales sobre la eficiencia de extracción del método MAE.
Exp DCM
(%)
Volumen
AcN (mL)
Potencia
(W)
Tiempo
(min)
Dilución
Hexano
1 -1 -1 -1 -1 1
2 1 -1 -1 -1 -1
3 -1 1 -1 -1 -1
4 1 1 -1 -1 1
5 -1 -1 1 -1 -1
6 1 -1 1 -1 1
7 -1 1 1 -1 1
8 1 1 1 -1 -1
9 -1 -1 -1 1 -1
10 1 -1 -1 1 1
11 -1 1 -1 1 1
12 1 1 -1 1 -1
13 -1 -1 1 1 1
14 1 -1 1 1 -1
15 -1 1 1 1 -1
16 1 1 1 1 1
17 -1 -1 -1 -1 1
18 -1 1 1 -1 1
19 -1 1 -1 1 1
20 -1 1 1 1 -1

33
4.5.3. Optimización de la Extracción
• Fortificación del Aceite
Se fortificaron 200 g de aceite de oliva extravirgen orgánico, para dar
concentraciones de 0,1 ug g -1
para dimetoato, diazinón, metilparatión,
metilpirimifos, malatión, fentión, clorpirifos, metidatión y 0,2 ug g -1
para
metilazinfos. Con este aceite se realizó completamente la optimización.
• Diseño de Optimización
Con el propósito de determinar la combinación de los factores e interacciones
(significativos) que nos proporcionen la respuesta óptima se realizó un Diseño
Doehlert o de Celda Uniforme (k2
+k+1) en el cual los tres factores (k) a optimizar
fueron: Potencia (W), Tiempo (min) y Volumen (mL). Este diseño consta de 13
experimentos (un centro incluido) el cual fue duplicado en su totalidad añadiendo
un centro adicional, por lo tanto se realizaron 27 experimentos en total, lo que
permitió mejorar la predicción y calcular el error experimental. La distribución de los
niveles para cada factor: Potencia, Tiempo y Volumen fue de 7, 5 y 3
respectivamente. En la tabla 4 se presentan los valores para los niveles de cada
factor y la matriz de diseño El análisis estadístico del diseño fue el mismo que para
el screening.
• Procedimiento de Extracción
Se masaron 5 g del aceite fortificado, se diluyeron en 5 mL de n-hexano (1:1) y se
le añadieron “x” (mL) de acetonitrilo. Luego pasaron al microondas donde se llevó a
cabo la extracción con “y” (W) de potencia por un tiempo de “z” (min). Luego se
separó el extracto en tubos de centrífuga donde se unió con los 2 mL del lavado del
sistema de extracción. Luego los extractos se evaporaron rotatoriamente a 50ºC y
se reconstituyeron en 32 mL de acetona, se le agregó TFF (0,1 μg mL-1
) y se
cuantificaron vía GC-FPD.

34
Tabla 4 Matriz, factores experimentales y niveles del diseño Doehlert para optimización del método MAE
Exp Valores Codificados Valores reales
z y x Tiempo (min) Potencia (W) Volumen (mL)
1 0 0 0 13 250 12,5
2 1 0 0 20 250 12,5
3 0,5 0,866 0 16 400 12,5
4 0,5 0,289 0,817 16 300 20
5 -1 0 0 5 250 12,5
6 -0,5 -0,866 0 9 100 12,5
7 -0,5 -0,289 -0,817 9 200 5
8 0,5 -0,866 0 16 100 12,5
9 0,5 -0,289 -0,817 16 200 5
10 0 0,577 -0,817 13 350 5
11 -0,5 0,866 0 9 400 12,5
12 -0,5 0,289 0,817 9 300 20
13 0 -0,577 0,817 13 150 20
14 0 0 0 13 250 12,5
15 0 0 0 13 250 12,5

35
• Extracción en las Condiciones Óptimas
Una vez determinadas las condiciones óptimas de extracción se realizó una
experiencia para verificar las recuperaciones bajo estas condiciones. Para esto se
masaron 5 g del aceite de oliva extravirgen fortificado que se usó para la etapa de
optimización, se le añadieron 5 mL de n-hexano y 15 mL de AcN.
Luego se llevó al microondas por 13 minutos a una potencia de 150 W. Luego se
separó el extracto en tubos de centrífuga donde se unió con los 2 mL del lavado del
sistema de extracción. Luego los extractos se evaporaron en rotavapor a 50ºC y se
reconstituyeron en 2 mL de acetona, se le agregó TFF (0,1 μg mL-1
) y se cuantificaron
vía GC-FPD.

36
4.6. CLEAN-UP MEDIANTE EXTRACCIÓN EN FASE SÓLIDA
Se realizaron una serie de experimentos destinados a evaluar la eficiencia en la
limpieza de los extractos mediante SPE. Se evaluó el efecto del tipo de adsorbente
(C18 o carbón grafitizado), el contenido de diclorometano en el solvente de elución (0 -
30%), el tipo de solvente de elución usado (metanol o acetonitrilo) y la necesidad de
usar este solvente para completar la elución de los pesticidas.
Para esto se masaron 5 g de aceite de oliva extravirgen orgánico por
cuadruplicado, se le agregan 5 mL de n-hexano y 15 mL de AcN. Luego se realizó la
extracción bajo las condiciones optimizadas de potencia y temperatura (150 W y 13
min) y una vez a temperatura ambiente se separan los extractos y se contaminan con
una masa de 0,1 µg g -1
para dimetoato, diazinón, metilparatión, metilpirimifos,
malatión, fentión, clorpirifos, metidatión y 0,2 µg g -1
para metilazinfos. Al mismo tiempo
se ambientan las columnas de SPE con 5 mL de AcN y se pasan los extractos para
luego eluir o no con 5 mL de MeOH (0 y 30 % de DCM) o 5 mL de AcN. El eluato
obtenido se evapora a 50 º C con un evaporador rotatorio, se reconstituye en 2 mL de
acetona, se le agrega TFF (0,1 μg mL-1
) y se cuantifica con GC-FPD.
4.7. VALIDACIÓN DEL MÉTODO PROPUESTO
En la figura 2 se presenta un esquema del método propuesto para extraer los 9
compuestos organofosforados desde el aceite de oliva. Se procedió a validar el método
determinando los parámetros de calidad analítica del mismo.

37
Acondicionado de columnas con 5 mL de AcN
Evaporación 50ºC
Se masan 5g de aceite de oliva y se
diluyen con 5 mL de Hexano
Agrego 15 mL de AcN
Extracción L-L MAE a 150W y 13 min
Clean up con columnas SPE LC-18
elución 5 mL AcN
Cuantificación GC-FPD
Fig. 2 Método de extracción

38
4.7.1. Determinación de Linealidad, Sensibilidad Analítica y
Límite de Cuantificación a Partir de la Recta de Calibración
Para determinar estos parámetros de calidad analítica se preparó una curva de
calibrado en medio de matriz con ocho puntos, para esto se masaron 5 g de aceite de
oliva extravirgen orgánico los cuales se disolvieron en 5 mL de n-hexano y se les
agregó 15 mL de AcN. Posteriormente se realizó la extracción y limpieza de estos
aceites bajo las condiciones óptimas obtenidas, y luego se evaporó el eluato a 50 º C,
se redisolvió en 2 mL de acetona, se añadió TFF (0,1 μg mL-1
) y los OPPs a los 8
niveles de concentración: 0,01; 0,02; 0,03; 0,04; 0,08; 0,1; 0,2; 0,4 μg mL-1
, en el caso
de Metilazinfos estas concentraciones fueron el doble. Finalmente las mediciones se
llevaron a cabo con GC-FPD.
4.7.2. Determinación de la Recuperación, la Precisión y el Límite de
Cuantificación del Método
Se fortificó aceite de oliva extravirgen orgánico a 3 niveles de concentración: bajo
(0,006 µg g -1
), medio (0,025 µg g -1
) y alto (0,1 µg g -1
), en el caso del Metilazinfos las
concentraciones fueron el doble. Cada nivel se sometió a extracción por sextuplicado
(n = 6) bajo las condiciones óptimas, luego la limpieza también se realizó en las
condiciones óptimas. Se evaporó el eluato, se reconstituyó en 2 mL de acetona se le
agregó TFF (0,1 μg mL-1
) y se cuantificó por GC-FPD.
El límite de cuantificación del método se determinó a partir de la desviación
estándar de la recuperación para el nivel de concentración menor (10 x DE)

39
4.8. ANÁLISIS ACEITE DE PALTA
Se forticaron 50 g de aceite de palta orgánico para obtener una concentración de 0,025
µg g-1
para Dimetoato, Diazinón, Metilparatión, Metilpirimifos, Malatión, Fentión,
Clorpirifos, Metidatión y de 0,05 µg g-1
para Metilazinfos. Luego se tomaron 5 g de este
aceite fortificado y se diluyó en 5 mL de n-Hexano, se le adicionaron 15 mL de AcN y
se sometió a extracción y limpieza según las condiciones óptimas de trabajo obtenidas
para aceite de oliva. Luego se evaporó el eluato, se reconstituyó en 2 mL de acetona y
se le agregó TFF (0,1 μg mL-1
4.9. COMPARACIÓN CON MÉTODO DE REFERENCIA*
Con el fin de comparar nuestro método con un método de referencia basado en
extracción líquido-líquido y SPE, se masaron 5 g de un aceite fortificado a 0,1 y 0,2 µg
g-1
de los 8 pesticidas organofosforados y Metilazinfos respectivamente, en un matraz
erlenmayer de 50 mL y se disolvieron en 5 mL de n-hexano. La extracción liquido-
liquido se realizó en un shaker rotatorio en dos etapas con 10 mL de AcN y un tiempo
de 5 minutos por vez. Luego se juntaron ambos extractos y se traspasaron 6 mL de
extracto a columnas SPE ENVI-CARB, previamente acondicionadas con 6 mL de AcN.
Posteriormente se eluyó con 12 mL de AcN, se evaporó con un evaporador rotatorio a
50 º C, se reconstituyeron los extractos con 2 mL de acetona, se les agregó TFF (0,1
μg mL-1
*(Amvrazi et al, 2006).

40
4.10. APLICACIÓN A MUESTRAS REALES
Para poner en práctica nuestro método se realizó el análisis de 22 aceites de oliva y 4
de palta que estuvieron disponibles en el mercado. Para esto se masaron 5 g de cada
aceite se diluyó en 5 mL de n-hexano, se le adicionaron 15 mL de AcN y se sometió a
extracción y limpieza según las condiciones óptimas de trabajo obtenidas. Luego se
evaporó, se reconstituyó en 2 mL de acetona y se le agregó TFF (0,1 μg mL-1
) y se
cuantificó por GC-FPD.
4.11. ENSAYO CONFIRMATORIO
Con el propósito de confirmar la presencia de los plaguicidas organofosforados
encontrados en las muestras reales se analizaron los extractos de estos aceites en un
cromatógrafo de gases con analizador de masa triple cuadrúpolo en tándem (GC-QqQ-
MS/MS). Para esto se evaporaron bajo corriente de nitrógeno los 2 mL de extracto en
acetona obtenidos, se reconstituyeron en 2 mL de ciclohexano y se cuantificaron vía
GC-QqQ-MS/MS.

41
5. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
5.1. MÉTODO CROMATOGRÁFICO
En la tabla 5 se presenta el orden y el tiempo de elución de los nueve plaguicidas
organofosforados (Dimetoato, Diazinón, Metilparatión, Metilpirimifos, Malatión, Fentión,
Clorpirifos, Metidatión, Metilazinfos) mediante el uso del programa de temperatura con
el cual se logra la mejor separación de las señales cromatográficas para los
compuestos antes mencionados. De acuerdo a los resultados obtenidos se observó
una buena resolución, aunque los compuestos Fentión y Clorpirifos se encuentran muy
cercanos entre sí (21,05 y 21,28 min respectivamente), pero esto no alcanza a ser
perjudicial para una correcta identificación y posterior cuantificación de los compuestos.
En la tabla 6 se presenta el programa de temperatura óptimo logrado y en la figura 3,
un cromatograma tipo en matriz.
Tabla 5 Tiempos de retención para cada plaguicida obtenidos con el programa de
temperatura óptimo
Orden Plaguicida Tiempo de retención (min)
1 Dimetoato 11,87
2 Diazinón 13,56
3 Metilparatión 16,63
4 Metilpirimifos 19,36
5 Malatión 20,35
6 Fentión 21,05
7 Clorpirifos 21,28
8 Metidatión 25,87
9 Metilazinfos 30,67

42
Tabla 6 Programa de temperatura para la separación de los 9 OPPs
Figura 3 Cromatograma obtenido por GC-FPD para los nueve plaguicidas 1.
dimetoato
2. diazinón; 3. m. paratión; 4. m.pirimifos; 5. malatión; 6. fentión; 7. clorpirifos; 8.
metidatión; 9. TFF (0.1 μg mL-1)
; 10.m. azinfos. A concentraciones de 0,2 μg mL-1
para
cada compuesto (excepto m. azinfos 0,4 μg mL-1
)
Tº Inicial (ºC) Tiempo (min) Rampa (ºC min‐1
) Tº Final (ºC)
70 2 ‐‐‐‐ 70
70 ‐‐‐‐ 30 180
180 18 ‐‐‐‐ 180
180 ‐‐‐‐ 25 280
280 4 ‐‐‐‐ 280

43
5.2. EXTRACCIÓN ASISTIDA POR MICROONDAS
5.2.1. Experimentos Previos
Dado que en los ensayos previos con MAE en sistema cerrado no se obtuvieron
rendimientos de extracción satisfactorios usando solo acetonitrilo, se pensó en la
posibilidad de realizar una extracción en dos etapas, pero dadas las complicaciones
prácticas que presenta el sistema cerrado para realizar esta tarea, se propuso la
realización de la extracción en sistema abierto en matraces erlenmayer de 50 mL. Es
importante señalar que al realizar las primeras pruebas en sistema abierto con las
condiciones de microondas iniciales (250 W, 2 min, 8 min) se evaporaba todo el
solvente, por lo que se hizo imprescindible buscar mejores condiciones para la
extracción en sistema abierto que se propone, evitando la pérdida del solvente por
evaporación durante el proceso.
• Extracción a potencias variables de microondas
En la tabla 7 se muestran los resultados obtenidos para la extracción a 200, 300, 400 y
500 W con “x” mL de acetonitrilo y 5 g de aceite. Podemos observar que a 300 W de
potencia se obtienen las mejores recuperaciones y que a 500 W se obtienen las más
bajas. Esto último se debió, sin duda, a la mayor pérdida de extractante (AcN) que
ocurre a esta potencia.
Tabla 7 Recuperaciones obtenidas a distintas potencias de microondas
Recuperaciones (%)
Plaguicida 200 W 300 W 400 W 500 W
Diazinón 41 52 45 13
Dimetoato 63 93 104 44
M. Pirimifos 40 52 45 17
Clorpirifos 37 46 38 12
M. Paratión 48 68 68 20
Fentión 32 42 30 11
Malatión 71 116 113 44
Metidatión 47 76 72 21
M. Azinfos 47 62 89 0

44
• Experiencias Realizadas a 300 W de Potencia
Una vez obtenida la potencia con la que se logran las mejores recuperaciones se
realizó una prueba por triplicado a 300 W con “x” mL de AcN, los resultados se pueden
ver en la tabla 8. De acuerdo a los valores obtenidos podemos observar una alta
dispersión de los datos (DE) y bajos valores de recuperación para algunos compuestos
como fentión, clorpirifos y metilazinfos que coincidentemente son de los compuestos
más hidrofóbicos de la serie (Anexo 4). Luego se realizó una extracción en dos etapas
con el fin de mejorar las recuperaciones de los compuestos anteriormente
mencionados (tabla 8). Podemos concluir a partir de esta tabla que las recuperaciones
no mejoraron, sino que mas bien se mantuvieron los valores de recuperaciones de la
extracción simple, a excepción del metilazinfos que aumentó casi el doble de su valor,
lo que nos indica que los compuestos están siendo extraídos en mayor parte en la
primera etapa, a excepción del metilazinfos. También podemos observar que la
repetibilidad mejoró considerablemente al pasar de una a dos etapas. Estos resultados
pueden ser explicados debido a la gran cantidad de solvente evaporado en la etapa de
extracción.
Tabla 8 Recuperaciones ± DE para extracción a 300 W en una y dos etapas (n=3)
Plaguicida Una etapa Dos etapas
x ± DE DER x ± DE DER
Diazinón 58 ±18 31 60 ± 10 17
Dimetoato 83 ± 23 28 83 ± 6 7
M. Pirimifos 61 ± 15 24 57 ± 9 16
Clorpirifos 49 ± 14 30 50 ± 9 18
M. Paratión 82 ±21 26 74 ± 6 8
Fentión 42 ± 11 26 49 ± 7 14
Malatión 100 ± 8 8 90 ± 1 2
Metidatión 68±21 31 73 ± 3 4
M. Azinfos 38 ± 7 17 77 ± 2 3

45
Posteriormente se evaluó el efecto de aumentar el volumen de extractante (AcN), esto
debido a las bajas recuperaciones de algunos compuestos y para contrarestar el efecto
de la pérdida de solvente, los resultados están en la tabla 9. De la que podemos
concluir que no solo no se logró mejorar las recuperaciones de los compuestos más
hidrofóbicos, sino que también disminuyeron las de los demás compuestos, de hecho
las menores recuperaciones siguieron correspondiendo a estos compuestos, además
también aumentó la dispersión de los datos. Esto no es lógico ya que al aumentar el
volumen de extractante deberían aumentar las recuperaciones pero podríamos
atribuírselo a la gran pérdida de solvente que ocurre. Luego se evaluó el efecto de
diluir el aceite en n-Hexano (1:1) (Lentza-Rizos et al, 2001) tabla 9, pero nuevamente
se obtienen bajas recuperaciones y alta dispersión de los datos. Por lo tanto es claro
que la evaporación del solvente es la limitante del sistema de extracción. A
continuación se presentan las tablas a) y b) las cuales corresponden al aumento del
volumen de AcN y la dilución con n-hexano respectivamente.
Tabla 9 Recuperaciones ± SD usando a) 10 mL de AcN y b) Diluyendo con n-hexano
a) b)
10 mL de AcN
Plaguicida x ± DE DER
Diazinón   38 ± 10 27
Dimetoato 60 ± 21 35
M. Pirimifos   39 ± 9 24
Clorpirifos   33 ± 9 27
M. Paratión   51 ± 15 29
Fentión 34 ± 12 35
Malatión 59 ± 16 27
Metidatión   50 ± 16 31
M. Azinfos 51 ± 23 46
Dilución
Plaguicida x ± DE DER
Diazinón   22 ± 6 27
Dimetoato 51 ± 10 20
M. Pirimifos   22 ± 5 24
Fentión 19 ± 4 23
Malatión 46 ± 11 25
M. Azinfos 55 ± 7 12

46
• Extracción Usando un Refrigerante Enfriado por Aire
Con el fin de evitar la evaporación del extractante se propuso el uso de un sistema de
refrigeración por aire acoplado al matraz erlenmayer de 50 mL (fig. 1), los resultados
de la extracción usando este sistema se pueden apreciar en la tabla 10. El objetivo del
uso de este sistema se cumplió satisfactoriamente, ya que en el trabajo experimental
se observó claramente una disminución de la evaporación del extractante AcN y al
analizar los datos arrojados por la extracción se observó un aumento considerable de
las recuperaciones de los compuestos (54 – 100%) incluidos los mas hidrofóbicos (que
siguen siendo los valores mas bajos), también se pudo apreciar una mejora de la
dispersión de los datos (DE entre 2 - 8). Por lo tanto podemos concluir que la limitante
que presentaba nuestro sistema inicial es la evaporación del extractante AcN y la etapa
siguiente fue optimizar la extracción empleando el sistema propuesto.
Tabla 10 Recuperaciones ± SD para extracción usando refrigerante (n=3)
Recuperaciones (%)
Plaguicida 1 2   3   x ± DE DER
Diazinón   68 62 62 64 ± 4 6
Dimetoato 89 85 89 88 ± 2 2
M. Pirimifos   62 53 58 58 ± 5 8
Clorpirifos   60 51 52 54 ± 5 9
M. Paratión   88 78 80 82 ± 5 6
Fentión 60 55 55 57 ± 3 6
Malatión 108 96 96 100 ± 7 7
Metidatión   67 66 70 68 ± 2 4
M. Azinfos 50 67 62 60 ± 8 14

47
5.2.2. Diseño Exploratorio Multivariado
Se considera evaluar el efecto de cinco factores experimentales sobre la eficiencia de
la extracción (% DCM en el solvente de extracción, volumen del solvente extractante,
potencia del microondas, tiempo de extracción y dilución del aceite en hexano).
En la tabla 11 se presenta la matriz de respuesta para el screening de la
extracción de los compuestos. En esta tabla se presentan los datos como
recuperaciones de los compuestos en porcentaje (%), más el aceite coextraído (mg g-1
)
y la función de deseabilidad total D. Con el fin de obtener los parámetros significativos
se realizó el análisis de la respuesta de cada compuesto y luego se obtuvo una
respuesta óptima múltiple que contuvo a todos los compuestos. La deseabilidad
observada fue obtenida dejando como valor mínimo (y min
) el menor valor de
recuperación obtenido en la serie de experimentos para el compuesto en particular y
como valor máximo (y máx
) el mayor valor del compuesto en la serie. Se escogió la
opción maximizar unilateralmente y se fijó el valor de los pesos s y t en 1.0 dejando con
un valor de 3.0 al coeficiente de impacto I (Anexo 2). Luego de obtenido el valor de
deseabilidad para cada experimento se analizó como respuesta en la matriz de diseño
y se obtuvo un modelo, el que posteriormente se analizó mediante herramientas
estadísticas. El modelo matemático obtenido se presenta a continuación.
MODELO MATEMÁTICO
Conveniencia = 0,397744 - 0,0336188 x %DCM + 0,0702563 x Volumen - 0,153169 x Potencia
- 0,0274875 x Tiempo + 0,0271625 x Diluído + 0,0451688 x % DCM x Volumen - 0,0318312 x %
DCM x Potencia - 0,0442625 x % DCM x Tiempo - 0,0751875 x % DCM x Diluído - 0,0216063 x
Volumen x Potencia + 0,0466 x Volumen x Tiempo + 0,03715 x Volumen x Diluído - 0,086775 x
Potencia x Tiempo - 0,0323 x Potencia x Diluído - 0,00234375 x Tiempo x Diluído

48
Tabla 11 Matriz de respuesta, % de recuperación, deseabilidad y aceite coextraído para diseño factorial fraccionado (25-1
).
Exp Dimetoato Diazinón M.Paratión M.Pirimifos Malatión Fentión Clorpirifos Metidatión M.Azinfos D Ac. Coext
mg g‐1
1 107 54 91 54 100 43 46 74 90 0,689681 4.82
2 83 48 69 50 100 33 41 61 67 0,475712 14.04
3 53 42 49 40 64 38 41 45 41 0.255868 8.56
4 87 56 72 55 108 46 50 79 80 0.603132 25.42
5 74 40 64 39 63 41 35 62 61 0.360869 3.98
6 62 27 51 27 51 32 24 44 50 0.163115 2.74
7 81 38 66 41 74 39 33 69 71 0.395968 5.96
8 81 40 66 42 66 46 35 63 63 0.396004 5.02
9 72 47 70 49 65 45 45 57 72 0.435161 5.22
10 72 35 65 38 55 44 30 49 62 0.302628 8.55
11 102 72 95 69 95 64 64 87 106 0.815832 7.29
12 92 62 82 61 74 70 56 83 90 0.677903 12.02
13 75 30 56 32 52 35 25 47 36 0.205147 2.54
14 44 23 37 21 39 19 18 31 19 0 1.89
15 71 37 64 35 59 35 27 54 50 0.279806 2.30
16 60 27 47 29 41 28 22 39 37 0.107405 2.05
17 76 40 65 41 111 31 35 59 67 0.391381 6.06
18 74 45 69 47 67 51 40 62 65 0.434595 3.84
19 96 75 98 73 100 76 69 96 122 0.894017 7.81
20 51 26 44 25 41 29 20 35 25 0.0648286 2.34

49
Luego de obtenido el modelo de la regresión de los factores experimentales en la
deseabilidad total, este fue evaluado usando el análisis de varianza ANOVA. El análisis
de la regresión se presenta en la tabla 12. Como podemos apreciar la regresión fue
significativa con un 90 % de confianza y el coeficiente de determinación fue de 0,9493
Tabla 12 ANOVA para el screening de la etapa de extracción
R2
= 0,9493
Source Sum of squares Df Mean Squares F‐Ratio P‐Value
Regression 1,1977 15 0,0798 4,993 0.065
Residual error 0,0639 4 0,0160
Total 1,2616 19

El test-t de Student para el 90 % de confianza y cuatro grados de libertad arrojó los
factores que son significativos para cada compuesto y para la función de deseabilidad
global. A partir de los diagramas de Pareto de los compuestos individuales (figura 4)
podemos notar que para todos los compuestos fue significativa la potencia
exceptuando al dimetoato, los otros factores que son significativos en su mayoría son
el volumen para diazinón, metilpirimifos, fentión, clorpirifos y la interacción Potencia-
Tiempo (CD) para metilpirimifos, fentión, clorpirifos, metidatión, metilazinfos. El test-t de
Student para la función de conveniencia global (figura 5) arrojó que los factores más
importantes son la potencia y el volumen de extractante los cuales tienen un efecto
negativo y positivo sobre la eficiencia de extracción respectivamente. También existen
interacciones con efecto significativo tales como la interacción entre potencia y tiempo
de extracción y entre %DCM y la dilución con n-hexano, ambas con un efecto
significativo negativo. Es decir se obtuvieron menores recuperaciones cuando se aplica
mayor potencia de extracción o por el uso de bajos volúmenes de solvente, por otro
lado la eficiencia de extracción aumenta cuando aumenta el tiempo de extracción al
menor poder aplicado (figura 6a) o cuando el aceite diluído con n-hexano fue extraído
usando sólo acetonitrilo (Figura 6b)

50
Standardized Pareto Chart for Metilparatión
0 1 2 3 4
Standardized effect
DE
BC
D:Tiempo+block
BE
AC
CE
E:Diluido
B:Volumen
AD
A:% DCM
AB
BD
AE
CD
C:Potencia
+
-
Standardized Pareto Chart for Diazinón
0 1 2 3 4 5 6
Standardized effect
DE
E:Diluido
D:Tiempo+block
AC
CE
AB
A:% DCM
AD
BC
BE
BD
AE
CD
B:Volumen
C:Potencia
+
-
Standardized Pareto Chart for Dimetoato
0 0.5 1 1.5 2 2.5 3
Standardized effect
BE
DE
BC
A:% DCM
D:Tiempo+block
CE
B:Volumen
AD
AC
BD
E:Diluido
CD
AB
AE
C:Potencia
+
-
Figura 4 Diagramas de Pareto de compuestos individuales para d.f.f (25-1
)
para Screening

51
Standardized Pareto Chart for Metilpirimifos
0 2 4 6 8
Standardized effect
DE
CE
E:Diluido
D:Tiempo+block
BC
AC
A:% DCM
AB
BD
AD
BE
AE
CD
B:Volumen
C:Potencia
+
-
Standardized Pareto Chart for Fentión
0 1 2 3 4 5
Standardized effect
BE
CE
DE
E:Diluido
AD
A:% DCM
D:Tiempo+block
BD
AC
AB
BC
AE
B:Volumen
C:Potencia
CD
+
-
Standardized Pareto Chart for Malatión
0 1 2 3 4
Standardized effect
B:Volumen
AC
DE
A:% DCM
BE
AD
AB
BC
E:Diluido
CD
CE
BD
AE
D:Tiempo+block
C:Potencia
+
-
Figura 1 Diagramas de Pareto continuación……

52
Standardized Pareto Chart for Clorpirifos
0 2 4 6 8
Standardized effect
E:Diluido
DE
AC
CE
D:Tiempo+block
BD
AB
AD
A:% DCM
BE
BC
AE
CD
B:Volumen
C:Potencia
+
-
Standardized Pareto Chart for Metidatión
0 1 2 3 4
Standardized effect
DE
A:% DCM
E:Diluido
BC
BE
D:Tiempo+block
CE
AD
AC
BD
AB
AE
B:Volumen
CD
C:Potencia
+
-
Standardized Pareto Chart for Metilazinfos
0 1 2 3 4 5
Standardized effect
BC
DE
AC
A:% DCM
D:Tiempo+block
CE
AB
BE
AD
E:Diluido
B:Volumen
BD
AE
CD
C:Potencia
+
-
Figura 4 Diagramas de Pareto continuación……

53
a) b)
-1,0
Tiempo=-1,0
Tiempo=1,0
Interaction Plot for Conveniencia
0
0,2
0,4
0,6
0,8
Conveniencia
Potencia
1,0
Tiempo=-1,0
Tiempo=1,0
-1,0
Diluido=-1.0
Diluido=1.0
Interaction Plot for Conveniencia
0,31
0,35
0,39
0,43
0,47
0,51
0,55
Conveniencia
% DCM
1,0
Diluido=-1.0
Diluido=1.0
Standardized Pareto Chart for Conveniencia
0 1 2 3 4 5 6
Standardized effect
DE
BC
E:Diluido
D:Tiempo+block
AC
CE
A:% DCM
BE
AD
AB
BD
B:Volumen
AE
CD
C:Potencia
+
-
Figura 5 Diagrama de Pareto para la función de conveniencia del Screening
Figura 6 Gráficos de interacciones para a) interacción dilución %DCM; b) interacción
Tiempo-Potencia

54
5.2.3. Optimización
Una vez definidos los factores significativos para la eficiencia de extracción, los cuales
son: potencia, tiempo y volumen de AcN, se procedió a optimizarlos simultáneamente
a través de un diseño Doehlert con siete, cinco y tres niveles respectivamente para
estos factores. Al igual que para el screening la deseabilidad para cada pesticida fue
obtenida por la maximización unilateral con s y t iguales a 1.0 u con I = 3.0. La
deseabilidad total puede apreciarse en la tabla 14 que corresponde a la matriz de
respuesta, la que también contiene los valores de aceite coextraído. A continuación se
presenta el modelo matemático obtenido por la regresión.
MODELO MATEMÁTICO
Conveniencia = 0,890488 - 0,0638832 x Tiempo - 0,476977 x Potencia + 0,121647 x
Volumen - 0,148329 x Tiempo2
- 0,115451 x Tiempo x Potencia - 0,0660609 x Tiempo x
Volumen - 0,506893 x Potencia2
- 0,133208 x Potencia x Volumen - 0,432218 x Volumen2
El modelo obtenido de la regresión de los factores en la deseabilidad total fue
analizado usando ANOVA (tabla 13)
Tabla 13 ANOVA para la optimización de la etapa de extracción.
R2
= 0,9230
Source Sum of squares Df Mean Squares F‐Ratio P‐Value
Regression 2.5791 9 0.2866 22.75 0,000
Residual error 0.2150 17 0.0126
Lack‐of‐ fit 0.0625 3 0.0208 1.908 0,174
Pure error 0.1525 14 0.0109
Total 2.7942

55
Exp Dimetoato Diazinón M.Paratión M.Pirimifos Malatión Fentión Clorpirifos Metidatión M.Azinfos D
Ac.Coext
mg/g
1 102 70 92 70 92 73 61 86 93 0.934303 8.48
2 99 49 69 48 83 52 40 70 80 0.673200 4.22
3 26 16 21 16 25 18 12 19 24 0 1.49
4 70 33 46 34 60 37 27 46 46 0.379711 3.01
5 98 62 80 66 87 69 53 81 83 0.836962 11.65
6 78 57 66 58 71 60 50 72 84 0.705226 11.89
7 95 46 72 48 75 55 39 70 74 0.652907 12.87
8 103 71 89 75 95 79 66 91 98 0.981037 11.54
9 85 41 62 42 69 47 35 59 56 0.534123 3.65
10 26 14 22 16 23 18 12 19 13 0 6.62
11 28 13 20 13 22 15 11 18 17 0 2.31
12 68 38 50 37 55 40 30 46 45 0.405036 3.03
13 88 67 75 69 80 70 66 79 78 0.835418 13.15
14 92 65 81 63 85 65 55 76 87 0.822384 7.06
15 97 48 70 48 82 51 39 72 82 0.669648 5.38
16 39 19 30 18 32 21 15 25 22 0.105574 2.64
17 57 25 38 24 45 29 19 36 46 0.239037 3.40
18 92 60 75 60 79 63 52 79 91 0.788825 11.51
19 98 66 80 70 82 72 60 85 93 0.882272 18.68
20 78 391 60 41 65 49 36 58 57 0.518136 8.63
21 105 68 89 73 89 76 64 87 86 0.934268 11.53
22 73 36 57 38 62 44 31 51 53 0.455621 3.72
23 51 23 38 23 39 27 20 30 32 0.200366 2.12
24 52 21 35 23 41 25 18 29 27 0.177688 6.14
25 98 54 77 57 82 63 46 72 76 0.744359 8.41
26 100 73 88 74 88 78 70 87 85 0.948307 11.12
27 104 71 85 70 93 72 58 85 89 0.914776 5.54
Tabla 14 Matriz de respuesta, % de recuperación, deseabilidad y aceite coextraído para diseño Doehlert de optimización.

56
Del análisis ANOVA podemos concluir que el modelo ajustado para la optimización
representa adecuadamente los datos ya que la carencia de ajuste (lack-of-fit) no fue
significativa para un 95% de confianza (P < 0,05), esto se ve reforzado por el hecho
de que el gráfico de los residuos para la deseabilidad total (figura 7) muestra un patrón
aleatorio. La regresión fue significativa para un 99,9 % de confianza y presentó un
coeficiente de determinación de 0,9230.
Figura 7 Presenta el gráfico de los residuos para la conveniencia
De acuerdo al test-t para 90% de confianza y cuatro grados de libertad podemos
observar que la potencia, el volumen y sus respectivos términos cuadráticos son
significativos, así también como el término cuadrático del tiempo, esto lo podemos
visualizar en la figura 8. Tanto la potencia como los términos cuadráticos de ella
misma, el volumen y el tiempo tienen un efecto negativo sobre la deseabilidad, es
decir, al aumentar estos disminuye esta última. En cambio el volumen presenta un
efecto positivo sobre la deseabilidad, es decir, cuando aumenta este aumenta la
deseabilidad.
Residual Plot for Conveniencia
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1
predicted
-0.22
-0.12
-0.02
0.08
0.18
0.28
residual

57
Figura 8 Diagrama de Pareto para la función de conveniencia
Del análisis de las superficies de respuesta individuales para los nueve
plaguicidas (figura 9) podemos observar que para todos fue significativa la potencia, el
volumen y sus respectivos términos cuadráticos, en cambio el tiempo sólo fue
significativo para clorpirifos, metilpirimifos, fentión y diazinón y su término cuadrático lo
fue para los mismos compuestos más el metilparatión. También la interacción entre
potencia y volumen fue significativa, aunque sólo para metilpirimifos, clorpirifos y
diazinón. De la superficie de respuesta global para la conveniencia vemos que existe
un máximo el cual corresponde a las condiciones óptimas de extracción y que se
encuentra cercano a los valores centrales de los factores estudiados (figura 10). Así las
condiciones de extracción óptimas obtenidas fueron una potencia de 150 W por 13
minutos y 15 mL de acetonitrilo extrayendo 5 g de aceite de oliva disuelto con 5 ml de
n- hexano (1:1)(tabla 15).
Standardized Pareto Chart for Conveniencia
0 2 4 6 8 10 12
Standardized effect
AC
AB
BC
A:Tiempo
AA
C:Volumen
CC
BB
B:Potencia +
-

58
Estimated Response Surface
Tiempo=0.0
-1 -0.6 -0.2 0.2 0.6 1
Potencia
-1
-0.6
-0.2
0.2
0.6
1
Volumen
-30
-10
10
30
50
70
90
Diazinon
Tiempo=0.0
-1 -0.6 -0.2 0.2 0.6 1
Potencia
-1
-0.6
-0.2
0.2
0.6
1
Volumen
-20
0
20
40
60
80
100
MParation
Tiempo=0.0
-1 -0.6 -0.2 0.2 0.6 1
Potencia
-1
-0.6
-0.2
0.2
0.6 1
Volumen
-20
10
40
70
100
130
Dimetoato
Tiempo=0.0
-1 -0.6 -0.2 0.2 0.6 1
Potencia
-1
-0.6
-0.2
0.2
0.6
1
Volumen
-20
0
20
40
60
80
100
Malation
Tiempo=0.0
-1 -0.6 -0.2 0.2 0.6 1
Potencia
-1
-0.6
-0.2
0.2
0.6
1
Volumen
-30
-10
10
30
50
70
90
MPirimifos
Tiempo=0.0
-1 -0.6 -0.2 0.2 0.6 1
Potencia
-1
-0.6
-0.2
0.2
0.6
1
Volumen
-17
3
23
43
63
83
Fention
Tiempo=0.0
-1 -0.6 -0.2 0.2 0.6 1
Potencia
-1
-0.6
-0.2
0.2
0.6
1
Volumen
-30
0
30
60
90
120
Metidation
Tiempo=0.0
-1 -0.6 -0.2 0.2 0.6 1
Potencia
-1
-0.6
-0.2
0.2
0.6
1
Volumen
-40
-10
20
50
80
110
MAzinfos
Tiempo=0.0
-1 -0.6 -0.2 0.2 0.6 1
Potencia
-1
-0.6
-0.2
0.2
0.6
1
Volumen
-27
-7
13
33
53
73
Clorpirifos
Figura 2 Superficies de respuesta individuales para los 9 OPPs diseño Doehlert de optimización

59
Figura 10 Superficie de respuesta global obtenida a partir de la optimización de la
función de conveniencia.
Tabla 15 Resultado de la optimización
Factor Bajo Alto Óptimo Óptimo
Codificado Valor real
Tiempo (min) ‐1,0 1,0 ‐0,0735772 12,5
Potencia (W) ‐0,866 0,866 ‐0,491263 152,7
Volumen (mL) ‐0,817 0,817 0,222055 15,2
A continuación, en la tabla 16 se presentan las recuperaciones obtenidas luego de
realizar la extracción bajo las condiciones óptimas (n=4) y se compara con los valores
de recuperación predichos por el modelo para la respuesta múltiple para cada
compuesto
.

60
Tabla 16 Comparación entre el resultado obtenido experimentalmente en las
condiciones óptimas comparado con el óptimo predicho.
Plaguicidas Recuperaciones (%)
x ± DE DER Óptimo *
Dimetoato 102 ± 10 10 105
Diazinón 80 ± 9 11 77
M. Paratión 97 ± 12 12 92
M.Pirimifos 82 ± 9 11 78
Malatión 98 ± 12 12 95
Fentión 88 ± 13 15 80
Clorpirifos 80 ± 12 15 69
Metidatión 93 ± 12 13 92
M Azinfos 93 ± 8 9 98
* El valor óptimo corresponde al predicho por la optimización de la función de conveniencia
Como se puede ver, los valores obtenidos y los predichos son muy parecidos, pero
para confirmar esta apreciación se realizó el test de contraste t para datos
emparejados con el fin de analizar el grupo de los compuestos en su conjunto. El valor
del t experimental (t = d √ / ) fue de 1,81 y el valor de t tabulado t 99%
(n-2) fue de
3.36, por lo tanto no se rechaza la hipótesis nula H0, la que plantea que no hay
diferencias significativas para los valores experimentales y los predichos. Esta es otra
prueba de la buena predicción que tiene el modelo

61
5.3. LIMPIEZA DE LOS EXTRACTOS
En esta experiencia se buscó analizar la influencia que tiene sobre la recuperación de
los 9 pesticidas y sobre la coextracción de aceite el probar diferentes columnas de SPE
(C18 y Envi-Carb) y diferentes solventes de elución escogidos según información
previa. Esto se realizó ya que luego de terminada la optimización de la extracción se
obtuvieron valores de aceite coextraído de 12 ± 2 mg g-1
para (n = 4), los cuales están
en concordancia con valores obtenidos por otros investigadores para extracción L-L
usando como extractante acetonitrilo/hexano (Lentza-Rizos et al (a), 2001; Amvrazi et
al, 2006; Cabras et al (a), 1997). Los resultados se presentan en la tabla 17, de la que
podemos ver que los mejores resultados en términos de mayores recuperaciones de
los compuestos y menor aceite coextraído se lograron con las columnas C18 con una
elución de 5 mL de acetonitrilo, con un residuo de aceite de 2,7 mg g-1
y con unas
recuperaciones que están en el rango entre 93 y 112 %.
Tabla 17 Aceite coextraído y recuperación de los 9 OPPs para diferentes métodos de
limpieza
Método de Limpieza Aceite Coextraído
(mg g‐1
)
Recuperación OPPs
(%)
SPE C18
Sin Elución
2.6 ± 0.5 81 – 102
SPE C18
Elución 5 mL MEOH
5.7 ± 1.0 100 – 108
SPE C18
Elución 5 mL MEOH‐DCM (30%)
9.3 ± 0.7 68 – 78
SPE C18
Elución con 5 mL de AcN
2.7 ± 0.5 93 – 112
SPE ENVI‐CARB
Sin elución
2.1 ± 0.4 82 – 89
SPE ENVI‐CARB
Elución con 5 mL AcN
2.3 ± 0.3 87 – 99

62
5.4. VALIDACIÓN DEL MÉTODO PROPUESTO
Se realizó la determinación de los parámetros de calidad analítica (Báez et al, 1999;
Miller et al, 2002) para el método propuesto para la determinación de los 9 plaguicidas
organofosforados por GC-FPD, los resultados obtenidos se resumen en la tabla 18 y
en la tabla 19. Se estudió la linearidad en el intervalo de 0,01 – 0,4 µg mL-1
(0,004 –
0,160 µg g-1
), excepto para Metilazinfos, el que fue estudiado en el intervalo de 0,02 –
0,8 µg mL-1
(0,008 – 0,320 µg g-1
) utilizando patrones preparados en matriz, luego de
pasar estos por las etapas de extracción y limpieza. Los gráficos de calibración lineal
fueron construidos a través de la regresión de los mínimos cuadrados de la
concentración (µg mL-1
) versus la razón de área del patrón con respecto al patrón
interno (analito / PI). Las curvas de calibración se presentan en el Anexo 1. De los
resultados podemos observar que la respuesta de todos los compuestos fue lineal en
el intervalo estudiado con coeficientes de correlación r de 0,999 para todos los
compuestos, además el parámetro (1- Sb/b) es mayor que (1 - 0,1/t95%
, n-2), lo que nos
da un mejor índice de linealidad, ya que tiene en cuenta el cambio de la pendiente. La
sensibilidad analítica (Sy/x/b, donde Sy/x es la desviación estándar de la regresión) la
cual indica la mínima diferencia en concentración detectada por el método estuvo entre
0,002 y 0,003 µg g-1
. Los límites de cuantificación del método (mLOQ) fueron obtenidos
mediante la fortificación de un aceite de oliva a una concentración de 0,006 µg g-1
y
sometiéndolo al método de preparación de la muestra (diez veces la desviación
estándar de la señal obtenida para n = 6). Los valores de mLOQ están comprendidos
entre 0,004 y 0,015 µg g-1
.
Los limites de cuantificación de la regresión del modelo rLOQ también fueron
obtenidos, aunque mediante la expresión 10(Sy/x/b) [(n-2)/(n-1)]1/2
y trabajando con los
puntos de la zona mas baja de la curva de calibración de cada compuesto. Los
resultados se encontraron entre el intervalo que comprende 0,001 y 0,010 µg g-1
. La
precisión del método expresada como desviación estándar relativa DER para n = 5 fue
determinada en un aceite de oliva fortificado a 0,025 µg g-1
, como resultado los valores
fueron iguales o menores que 6%, excepto para Metilazinfos con un valor de 8 %.

63
Los estudios de recuperación para tres niveles de concentración se presentan en la
tabla 19, las recuperaciones para el nivel más bajo de concentración (0,006 µg g-1
) se
encuentran en el intervalo entre 66 y 88% con una DER comprendida entre 4 y 28.
Para el nivel medio (0,025 µg g-1
) las recuperaciones se encuentran entre 74 y 99 %
con una DER entre los valores 4 y 8. Por último las recuperaciones para el nivel más
alto de concentración (0,1 µg g-1
) se encontraron entre el rango entre 72 y 93 % con
una DER comprendida entre 5 y 10%. .

64
*El valor de (1 - 0,1/t
95%
, n-2), es de 0.9640 para: M.Paration, M.Pirimifos, Malatión, Fentión, Clorpirifos; 0,9611 para Diazinón y Metidatión; 0,9592 para
Dimetoato y M.Azinfos.
Plagicidas Rango Lineal R    1‐Sb/b* Sy/x/b mLOQ rLOQa
RSDb

μg g‐1
μg g‐1
μg g‐1
μg g‐1

Dimetoato 0,004‐0,160 0,999 0.986 0,005 0,004 0,003 5
Diazinón   0,004‐0,160 0,999 0.980 0,007 0,004 0,001 5
M. Paratión   0,004‐0,160 0,999 0.981 0,007 0,015 0,009 4
M. Pirimifos 0,004‐0,160 0,999 0.984 0,005 0,008 0,003 6
Malatión 0,004‐0,160 0,999 0.978 0,008 0,007 0,001 6
Fentión   0,004‐0,160 0,999 0.982 0,006 0,009 0,006 6
Clorpirifos 0,004‐0,160 0,999 0.979 0,007 0,004 0,007 5
Metidatión 0,004‐0,160 0,999 0.980 0,007 0,007 0,008 4
M. Azinfos 0,008‐0,320 0,999 0.988 0,008 0,024 0,010 8
Tabla 18 Tabla que presenta los parámetros de calidad analítica del método MAE-SPE y GC-FPD

65
Tabla 19 Porcentajes de recuperación ± DE (n=6) de los 9 OPPs para tres diferentes concentraciones
a,b,c : La concentración de M. Azinfos para cada una de estas tres concentraciones fue el doble del valor presentado
Plaguicidas Recuperaciones %
0,006 a
μg g‐1
0,025 b
μg g‐1
0,1 c
μg g‐1

Dimetoato 72 ± 6 94 ± 5 93 ± 6
Diazinón 70 ± 6 77 ± 4 80 ± 8
M. Paratión 70 ± 3 91 ± 4 90 ± 7
M.Pirimifos 81 ± 13 78 ± 5 73 ± 4
Malatión 85 ± 11 99 ± 6 86 ± 6
Fentión 72 ± 14 81 ± 5 76 ± 4
Clorpirifos 63 ± 6 74 ± 4 72 ± 5
Metidatión 88 ± 11 89 ± 4 82 ± 5
M Azinfos 74 ± 21 97 ± 8 87 ± 9

66
5.5. ANÁLISIS ACEITE DE PALTA
El método propuesto también se hizo extensivo a un aceite de palta extravirgen
contaminado con una concentración de 0,025 ug g-1
. De los resultados (tabla 20)
podemos observar que las recuperaciones se mantuvieron en el rango comprendido
por 71 y 102 %, excepto por el fentión que presentó un valor de 57 % y las
desviaciones estándar relativas (DER) en el rango entre 4 y 13. Se encontró también
que los compuestos que presentan las menores recuperaciones (fentión, clorpirifos, y
metilpirimifos) corresponden a los que tienen la menor solubilidad en agua o así
también el mayor logaritmo del coeficiente de partición octanol / agüa (log Kow) (Anexo
4). El aceite coextraído (9 ± 1 mg g-1
) fue aproximadamente cuatro veces la cantidad
obtenida para aceite de oliva luego de la etapa de limpieza. Esto es debido sin duda a
la mayor cantidad de ácidos grasos que contiene el aceite de palta.
Tabla 20 Resultados obtenidos para la extracción de los 9 OPPs en aceite de palta
(n=6)
Plaguicidas Recuperaciones (%)
x ± DE DER
Dimetoato 91 ± 7 8
Diazinón 83 ± 8 9
M.Pirimifos 73 ± 9 13
Malatión 90 ± 5 6
Fentión 57 ± 2 4
M. Azinfos 91 ± 10 11

67
5.6. COMPARACIÓN CON MÉTODO DE REFERENCIA
Con el fin de comparar nuestro método con uno de referencia se eligió un método de
extracción liquido- liquido con limpieza SPE y columnas de carbón grafitizado (ENVI-
CARB) (Amvrazi et al, 2006). Los resultados se presentan en la tabla 21. De la tabla
podemos observar que las recuperaciones son relativamente similares, con la
excepción de que en el método de referencia (L-L SPE), las obtenidas para Clorpirifos
y Metilazinfos son considerablemente bajas (25 y 30 % respectivamente). La baja
recuperación para el Clorpirifos se debe a que es el compuesto más hidrofóbico de la
serie, por lo tanto es más difícil de extraer. En el caso del Metilazinfos no está muy
claro el motivo de su baja recuperación, pero se propone que es debido al corto tiempo
sometido a la extracción (5 minutos en un agitador rotatorio). Es importante destacar
que en el método de referencia se produce una emulsión muy difícil de romper, lo que
no ocurre con nuestro método. También en necesario resaltar la alta frecuencia de
análisis de nuestro método, sumado al moderado consumo de solvente y el corto
tiempo de trabajo comparado con este método de referencia (20 mL de AcN contra 32
mL de AcN por muestra)
Tabla 21 Tabla que presenta la comparación entre ambos métodos (L-L vs L-L MAE)
para n=6
Recuperaciones (%)
Plaguicidas L‐L * L‐L MAE
x ± DE DER x ± DE DER
Dimetoato 86 ± 5 5 93 ± 6 6
Diazinón 79 ± 5 6 80 ± 8 10
M. Paratión 91 ± 6 6 90 ± 7 8
M.Pirimifos 85 ± 5 6 73 ± 4 5
Malatión 91 ± 7 8 86 ± 6 7
Fentión 93 ± 7 7 76 ± 4 5
Clorpirifos 25 ± 4 17 72 ± 5 7
Metidatión 86 ± 3 4 82 ± 5 6
M. Azinfos 30 ± 5 17 87 ± 9 10
*(Amvrazi et al, 2006).

68
5.7. APLICACIÓN A MUESTRAS REALES
El método desarrollado y validado para el análisis de los nueve plaguicidas
organofosforados fue aplicado a 22 aceites de oliva extravirgen y a 4 aceites de palta
comercializados en Chile en el momento de realizar los análisis. Los resultados se
pueden ver en la tabla 22. Los resultados arrojaron que 17 de las 26 muestras fueron
positivas (86 % del total) en cinco de los nueve pesticidas con los que se trabajó. El
pesticida mas frecuentemente encontrado fue clorpirifos, este pesticida fue encontrado
en 13 muestras (50%) en un rango de concentraciones que fluctúa entre 0.003 y 0.232
μg g-1
, el pesticida que le sigue fue diazinón, encontrado en 7 muestras (27%) con un
rango entre 0.003 y 0.112 μg g-1
, luego se encontró metidatión en 4 muestras (15%)
con un rango de concentraciones 0.003 y 0.010 μg g-1
, le sigue metilazinfos con 3
resultados positivos (12 %) a 0.015, 0.022 and 0.032 μg g-1
y por último metilparatión
que fue encontrado en una muestra (4%) a 0.003 μg g-1
. Es importante resaltar que
ninguno de los aceites analizados contenía residuos en concentraciones mayores a las
estipuladas por la WHO/FAO en su Codex Alimentarius para olivos y aceite de oliva
(Codex Alimentarius Comission, 1996).
También es importante observar que casi todos los aceites analizados de la
región central del país correspondientes a los valles de: Aconcagua, Aculeo, Maipo,
Curacaví y Cachapoal contienen sólo residuos de clorpirifos y que los pesticidas
encontrados: clorpirifos, diazinón, metidatión, corresponden a los pesticidas
recomendados para el tratamiento de las pestes que causan más daño en los olivos
en nuestro país (Prado et al, 2003) y también a los cuatro plaguicidas
organofosforados más vendidos en nuestro país (SAG, 2006).

69
Tabla 22 Tabla que presenta las concentraciones en μg g-1
para los aceites analizados
Aceite Diazinón M.Paratión Clorpirifos Metidatión M. Azinfos
Olioliva
Mestre 0,005 (T) 0,124 (0,142)
Razeto Oliva 0,232 (0,255)
La Crianza 0,038 (0,044)
Sol de
Aculeo
0,062 (0,073) 0,003 (nd)
Montecristo 0,024 (0,028)
Olave 0,016 (0,014)
Terra Santa 0,007 (0,007)
Kardamili F. 0,085 (0,098)
Kardamili C. 0,074 (0,101)
Kardámili A. 0,065 (0,077)
Casta 0,100 (0,097) (T) 0,015(0,016)
1492 0,003 (nd) 0,007(0,005)
Canepa 0,112 (0,147) 0,003 (nd) 0,003 (T) 0,032(0,026)
Petralia 0,088(0,081) 0,022(0,023)
Las
Doscientas

El Cerrito
Oveja Negra 0,108 (0,110)
Oro Maule 0,003(nd) 0,010(0,008)
Aresti 0,004(nd) 0,004 (nd) 0,007(0,007)
Carbonell 0,002 (T)
Borges
Alwe
Del Palto 0,002 (nd)
Lamay
Razeto Palta
MRL a
nr nr nr 1,00 nr
MRL b
0,01 0,02 0,05 1,00 0,05
Los valores entre paréntesis corresponden a los obtenidos por GC-MS-MS; MRL
a
: Nivel de residuos máximos
permitidos en aceite de oliva; MRL:
b
: Nivel de residuos máximos permitidos en olivos; T=traza; nd= no
detectado.(Codex Alimentarius Comission,, 1996)

70
5.8. ENSAYOS CONFIRMATORIOS
Para comprobar los resultados obtenidos por nuestro método se analizaron las
muestras que dieron resultados positivos mediante GC-MS-MS. Los resultados
obtenidos se muestran en la tabla 22. De los resultados podemos observar que la
mayoría de los resultados obtenidos por el método propuesto se confirman según esta
última técnica (77 % de compuestos encontrados también fueron confirmados por GC-
MS-MS), cabe señalar que para algunos compuestos la sensibilidad de este último
método no fue la suficiente para confirmar su presencia, siendo encontrados por
nuestro método en concentraciones bajas (alrededor de 0,002 μg g-1
). También es
importante destacar que para los compuestos que fueron confirmados por GC-MS-MS
las concentraciones fueron bastante cercanas comparadas con las obtenidas según
nuestro método. A continuación se presentan los cromatogramas de GC-MS/MS (TIC,
total ion current) de: a) extracto de un aceite de oliva orgánico combinado con los 9
OPPs mas TFF y b) una muestra real (aceite Mestre)

71
Figura 11 Cromatograma obtenido en GC-MS-MS (TIC) de a) Muestra real (Mestre).
Pesticidas: 1. Dimetoato; 2. Diazinón; 3. M.Paratión; 4. M.Pirimifos; 5. Malatión;
6. Fentión; 7. Clorpirifos; 8. Metidatión; 9. TFF (0,1 μg mL-1
); 10. M.Azinfos.
Cromatograma obtenido en GC-MS-MS (TIC) de b) extracto de aceite de oliva extra
virgen orgánico fortificado a 0,2 μg mL-1
(M. Azinfos 0,4 μg mL-1
)

72
1. CONCLUSIONES
• El método cromatográfico usado para la identificación y posterior cuantificación
de los compuestos (GC-FPD y su correspondiente programa de temperatura)
permiten una separación satisfactoria de los nueve plaguicidas estudiados, lo
que a su vez permite un correcto desarrollo del método analítico propuesto.
• El sistema propuesto para llevar a cabo la extracción de los OPPs desde aceite
asistida por microondas a presión atmosférica resultó ser exitoso (matraz
erlenmayer de 50 mL acoplado con un refrigerante enfríado por aire) en la
mejora de las recuperaciones de los residuos de los plaguicidas bajo estudio.
• El diseño exploratorio multivariado usado (diseño factorial fraccionado 25-1
)
resultó ser de mucha ayuda a la hora de planificar los experimentos que nos
llevaron a la obtención de los factores significativos para nuestro método,
resultando en un importante ahorro de tiempo y de trabajo. Posteriormente
estos factores fueron optimizados mediante un diseño Doehlert, obteniéndose
así las condiciones óptimas de trabajo. De esto se concluye la importancia de
las herramientas quimiométricas a la hora de planificar, ejecutar y analizar los
resultados de un experimento.
• El uso de la función de deseabilidad D de Derringer y Suich permitió enfrentar el
problema de un análisis de respuesta múltiple al aglomerar todas las
respuestas obtenidas en una sola y poder analizarla como tal, maximizándola.

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• La etapa de limpieza (clean-up) es importante en la etapa de preparación de
muestra de nuestro método ya que minimiza el aceite que se co-extrae en la
extracción de los residuos de plaguicidas mediante el método MAE. En la
práctica, el uso de las columnas de extracción en fase sólida LC18 nos permitió
reducir el contenido de este aceite de 12 mg g-1
a 3 mg g-1
lo que significa una
reducción del 75 % de aceite.
• El método de extracción líquido-líquido asistido por microondas a presión
atmosférica con ulterior limpieza mediante extracción en fase sólida y
cuantificación con GC-FPD es un método simple, de consumo moderado de
solvente, de bajo tiempo/muestra y selectivo. Lo que lo convierte en un método
ideal para análisis de rutina en un laboratorio de análisis de plaguicidas en
aceite de oliva y palta.
• La aplicación de nuestro método al análisis de aceites de oliva y palta que se
encontraron en el comercio al momento de realizar este trabajo evidenció la
presencia de residuos de plaguicidas organofosforados en estos. De un
universo de 26 muestras, el 50% presentó residuos de clorpirifos en un rango
de concentraciones de 0.003 y 0.232 μg g-1
, luego un 27 % presentó diazinón
en un rango de 0.003 a 0.112 μg g-1
, metidatión en un 15% de las muestras
0.015 - 0.032 μg g-1
y por último metilparatión que fue encontrado en una
muestra (4%) a 0.003 μg g-1
.

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