Este documento proporciona información sobre diferentes tipos de tinción de microorganismos, incluyendo tinción de Gram, ácido-resistente, esporas y cápsula. Explica los conceptos clave como cromóforo, auxócromo y colorante, y los pasos para la preparación y lectura de diferentes tinciones. El objetivo es conocer las ventajas de la tinción de microorganismos y aprender habilidades para identificar bacterias usando tinciones diferenciales y selectivas.
Criterios ESG: fundamentos, aplicaciones y beneficios
Tinciones de micobiologia
1. Introducción a las tinciones
n Tinción de Gram
n Tinción de Cápsula
n Tinción de Esporas
n Tinción de Ziehl-Neelsen
n Tinción Negativa (Dugid)
2. Objetivos
n Conocer las ventajas de la tinción de microorganismos
n Conocer el mecanismo básico de una tinción
n Aprender las destrezas del proceso de preparación de
un frotis y el ensayo de diferentes tinciones
diferenciales y selectivas: Gram, ácido-resistente,
esporas y cápsula
n Establecer las diferencias entre bacterias basadas en las
tinciones
3. CROMÓFORO
• Da la característica de color a una substancia pero no tiñe, ya que carece de
afinidad o capacidad para unirse a fibras o tejidos.
-NO2 -N=N- -N=O -N=
Nitro Azo Nitroso Indámico
C=S- N -N=N+- -S= N+
N O- -N-
Tiocarbonil Acina Azoxi Tiacina
Un grupo cromóforo + un anillo bencénico = cromógeno (no tiñe)
4. AUXÓCROMO
• Grupo que le confiere a una substancia la
propiedad de disociación electrolítica, es decir,
formar sales y por lo tanto da la capacidad a un
cormógeno de fijarse y teñir.
• OH-
• H+
6. Tipos de colorantes
n Básicos- Tienen carga catiónica. La porción del
cromógeno tiene carga positiva y poseen gran afinidad
por los componentes celulares negativos.
n Estos colorantes son los más utilizados debido a que las
bacterias tienen una superficie con carga negativa.
n Ejemplo: Azul de metileno, cristal violeta y
carbolfucsina
7. Tipos de colorantes (cont.)
n Ácidos- Tienen carga aniónica. La porción del
cromógeno es negativa y tienen gran afinidad
por los componentes celulares positivos.
n Las sales de sodio, potasio, calcio o amoniaco
de ácidos con color son ionizados para producir
un cromógeno con carga negativa.
8. MORDENTE
• Cualquier substancia que forme compuestos
insolubles con los colorantes y determine su
fijación a una estructura determinada.
• Ejemplo: Lugol (I), fenol, oxalato de amonio, ácido tánico,
sulfato de anilina, etc.
9. FIJADOR
• Substancia que va a permitir conservar en su
lugar a las estructuras correspondientes por
medio de la coagulación de sus moléculas.
• Ejemplo: metanol, formol, tetróxido de osmio, calor (no >
60ºC)
10. Preparación del frotis:
n Limpiar la laminilla con papel de lentes. Libre de grasa
n Prepara el frotis
n Medio líquido- solo se coloca de 2 a 3 asadas del
cultivo en la laminilla. (Agitar)
n Medio sólido- se coloca una gotita de agua en la
laminilla y se diluye la porción de cultivo en ella.
Se esparce bien.
n Secar a temperatura ambiente
n Fijación por calor
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12. TINCIONES
• Simple
• Usa un solo colorante
• Diferenciales: Gram y Ziehl-Neelsen
• Usa dos colorantes
• Primario
• Secundario o de contraste
• Mordente
• Diferenciación (decoloración)
• Selectivas
• Usa uno o más colorantes
• Mordente
13. TEORÍAS
• Física: Es un fenómeno o proceso físico, es una reacción
entre dos substancias sin formación de un nuevo
compuesto. Todas las reacciones se explican por
fenómenos de capilaridad, ósmosis, adsorción y
absorción.
• Química: Es una reacción donde se forma un compuesto
nuevo con propiedades físicas y químicas diferentes a las
que muestras las substancias originales reaccionantes.
15. Tinción simple
n Utilizada para observar la forma, la
agrupación, el tamaño y la presencia de
esporas.
n Se utiliza un solo colorante.
n tinción directa se tiñe a la bacteria.
n Tinción negativa tiñe el fondo pero no a la
bacteria
16. TINCIÓN SIMPLE
• Permite observar la forma, tamaño, agrupación de
las bacterias usando un solo colorante
(generalmente básico)
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18. Tinción diferencial
n Tinción diferencial: es una gran herramienta para
separar y clasificar a los microorganismos.
n Utiliza dos colorantes y un mordente.
n El primer colorante aplicado es el primario. Después de
él suele hacerse la diferenciación (decoloración). El
colorante secundario o de contraste, se adiciona para
establecer la diferenciación de las bacterias.
n Ejemplo: Tinción Gram y Ziehl-Neelsen
19. Tinción de GRAM
n Colorante primario- cristal violeta, tiñe la bacteria de
color morado
n Agente mordente- Yodo- forma un complejo insoluble
con cristal violeta y los compuestos protoplásmicos.
Ayuda a adherir el tinte a la célula. Ayuda a resistir la
decoloración
n Agente decolorante- alcohol etílico al 95% y acetona, el
cual sirve como solvente de lípidos y agente
deshidratante de proteínas.
n Colorante secundario-safranina-tiñe de rojo a la
bacteria
20. Preparación de la tinción de
Gram
n Preparación del frotis
n Cristal violeta (30 segundos -
1minuto)
n Lavar con agua
n Yodo (1 minuto)
n Lavar con agua
n Alcohol etílico-acetona
suavemente (5-15 segundos)
n Lavar con agua
n Safranina (45-60 segundos)
n Lavar con agua
n Secar al aire
24. TINCIÓN DE GRAM
Tinción de Gram de una muestra de líquido cerebro-
espinal infectado con Bacillus anthracis
25. Tinción Alcohol-Ácido Resistente
n Las familias Mycobacteriae y Nocardiaceae son
alcohol-ácido resistente.
n Los microorganismos alcohol-ácido resistentes se
caracterizan por tener una pared celular gruesa de
cera (lipoidal) que contiene ácido micólico.
n Los organismos que son decolorados por el
alcohol ácido no son ácido resistente.
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27. Tinción Alcohol-Ácido Resistente:
Ziehl-Neelsen
n Colorante primario- Carbolfucsina (fenol 5%). Puede
penetrar la pared
n Agente decolorante- alcohol ácido (3% HCl +95%
alcohol etílico)
n Colorante secundario o contrasto: Azul de metileno se
utiliza para teñir de azul las bacterias que quedaron
incoloras
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29. Preparación de la tinción
alcohol-ácido resistente
n Preparar un frotis
n Carbolfucsina (3 minutos). Cubrir completamente y
calentar a emisión de vapores por 5 minutos. No hervir.
n Lavar con agua
n Decolorar con alcohol etílico-HCl
n Lavar con agua
n Azul de metileno por 1-2 minutos
n Lavar con agua
n Secar al aire
30. Tinción de esporas
Método de Schaffer-Fulton
n Célula vegetativa- forma metabólicamente activa =
bacterias
n Esporas- forma metabólicamente inactiva y altamente
resistente
n Los miembros del género anaerobio Clostridium,
Desulfotomaculum y Bacillus pueden existir
metabólicamente activos o inactivos.
31. Formación de esporas como
método de sobrevivencia
§ Condiciones ambientales
hostiles, ocurre esporo-
génesis la cual forma la
espora. Condiciones ambien-
tales favorables, ocurre
germinación, lo cual forma la
célula vegetativa
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33. Preparación de la tinción
de esporas
n Preparar el frotis
n Verde Malaquita (2-3 minutos) a emisión de
vapores
n Dejar enfriar la laminilla y enjuagar con agua
n Safranina (30 segundos)
n Lavar con agua
n Secar al aire
35. Tinción de cápsula
n Cápsula: estructura gelatinosa secretada por
algunas bacterias
n Las células que tienen cápsula son virulentas y
causan enfermedades ya que protegen a la célula
de la acción fagocítica del hospedero.
n La mayoría de las cápsulas están compuestas de
polisacáridos, por lo que son solubles en agua.
36. Tinción de cápsula
§ Colorante primario- Cristal Violeta 1%- tiñe todo el
frotis color oscuro
§ Decolorante y Colorante de contraste- Sulfato de
Cobre 20%-se usa para enjuagar el tinte primario
§ No se enjuaga con agua por que la cápsula es
soluble en agua.- función de decolorante
§ El CuSO4 es absorbido en el material de la
cápsula que ha sido decolorada - función de
colorante de contraste
37. Preparación de tinción de cápsula
n Preparación de un frotis grueso
n Dejar secar a temperatura ambiente
n Cristal violeta 1% (5-7 minutos)
n Enjuagar con CuSO4
n Secar al aire
38. Tinción negativa
(Dugid)
n Ideal para poder observar la estructura de la
cápsula
n La tinción se logra mediante una mezcla del
colorante y el cultivo de bacteria
n El colorante utilizado es “ India Ink”(Tinta
China)
n Se le conoce como efecto de cielo estrellado
40. TINCIÓN DE KNAYSI. PARED
CELULAR
• Preparar el frotis
• Mordente de Kaysi (ácido tánico a sturación +
alumbre de potasio) 10 minutos
• Enjuagar con agua
• Colocar 1 gota de fucsina
• Colcar un cubreobjetos
• Observar a inmersión
43. TINCIÓN DE LOS FLAGELOS
• Los flagelos son estructuras demasiado finas
para poder ser visibles en el microscopio de luz.
• Frotis
• Mordente de ácido tánico para formar un
precipitado denso en la pared celular y en
los flagelos
• Teñir con fuscina básica
45. TINCIÓN DEL NUCLEOIDE
BACTERIANO
• Tinción de Feulgen la cual es específica
para el DNA.
• Frotis fijado con tetróxido de osmio
• Digerir con KOH calentando
• Cubrir con el colorante de Shift