1. CURSO: “BIOSEGURIDAD Y BIOTECNOLOGIA MODERNA”
Estudio de caso en bioseguridad:
4. Papaya GM
Jorge Benavides Ranilla
Instituto Nacional de Innovación Agraria, INIA
La Molina

2. Papaya, es un fruto tropical con alto
contenido de vitaminas A y C.
Es un cultivo rentable por dar frutos
en el primer año.
Contiene papaina para uso
industrial y medicinal.

3. Origen de la Papaya
Cultivated
Domesticated papaya
somewhere In Pacific
between Taken into Asia Islands
southern Mexico by 1800
and
tropics in the 1600s
Guatemala
Carica spp

4. Producción mundial de
Papaya
6000
5000
4000
1,000s mt
3000
2000
1000
0
1965 1970 1975 1980 1985 1990 1995 2000
FAOSTAT, 1965 - 2000

5. Producción mundial de
Papaya
Region País (1,000 TM)
Africa Nigeria (748), Ethiopia (215), Congo
(210)
Asia India (700), Indonesia (484)
Americas Brazil (1,476), Mexico (745)
FAOSTAT database, 2000-2002

6. Los 10 paises mayores productores de papaya son:
Brazil, Mexico, Nigeria, Indonesia, India, Ethiopa,
Congo, Peru, China y Filipinas.
Exportan Importan
Mexico y Brazil USA
USA (Hawaii) y
Filipinas Japon
Brazil y Holanda Union Europea
Reference: FAO (FAOSTAT) 2005

7. La papaya en el Perú
• Ranking
-- Peru es el 8° productor a nivel mundial
– 9° in the area sembrada (11,736 has)
– 6° en volumen produced (175,428 TM)
• Usos
– 99.9% consumo interno
– 0.01% es exportado,
– En conserva (25.4 TM)
– Congelada (4.9 TM)
– Fresco (0.22 TM)
• Ingresos por la exportación:
– US $ 58 mil/año en 2009
–La exportacion de papaya es debido a la presencia de la
enfermedad por PRSV
• Papaya cultivada es susceptible a la infección de PRSV
• PERDIDAS: 40%

8. CARACTERISTICAS GENERALES DEL VIRUS PRSV
• Virus de la Mancha Anillada de la
Papaya
• Miembro de la familia de los
potyvirus
• Forma de bastón alargado, partículas
de 800-900 nm en longitud
• RNA lineal de una sola hebra de 12 kb
total, encapsulado por una proteína
de cubierta

9. DATOS SOBRE EL CULTIVO DE PAPAYO
A NIVEL NACIONAL:
La producción nacional de papaya fue de 0.18 millones de toneladas
métricas en una superficie cultivada de 11,736 Ha (MINAG, 2006):
Cuadro: Perú producción, superficie cosechada y rendimiento de papaya
según Región o SubRegion 2006
Superficie
Región cosechada Producción Rendimiento
(Ha)
Nacional 11,736 175,428 14.95
Huanuco 2,333 32,543 13.95
Ucayali 3,757 70,884 18.87
Pasco 93 1,364 14.67
Loreto 632 7,308 11.56
San Martin 992 11,893 11.99
Cusco 744 11,748 15.79
Madre de Dios 179 1,763 9.85
Puno 268 2,663 9.94
Ayacucho 145 1,378 9.50
Junin 1,324 10,537 7.96
Apurimac 67 540 8.06
Fuente: Direcciones Regionales de Agricultura- Dirección de Información Agraria
Elaboración Ministerio de Agricultura. Dirección General de Información Agraria 2007

10. DATOS SOBRE EL CULTIVO DE PAPAYO
A NIVEL MUNDIAL:
La producción mundial de papaya fue de 5.4 millones de toneladas
métricas en una superficie cultivada de 340,594 Ha (FAO, 2001):
Rendimiento de Papaya por País - 2001
40
35
30
25
TM/ha
20
15
10
5
0
ia
a
a
ia
na
rú
o
go
il
di
si
as
nd
ic
er
Pe
hi
on
ne
In
ex
Br
ig
il a
C
C
do
N
M
Ta
In

11. PROBLEMÁTICA NACIONAL
 Presencia del virus de la mancha anillada (PRSV-P), que ocasiona
pérdidas de 12000 TM/año (40%).
 9 000 Ha de plantaciones infestadas equivalente a 25 000
productores afectados.
 No se conocen genes de resistencia naturales.

12. SINTOMAS DEL PRSV
enrrollamiento de hojas
aclaramiento de nervaduras
Exudado de tallo y
debilitamiento del pedúnculo
= caída de frutos
12
Manchas circulares en el fruto

13. VIRUS TRANSMITIDO POR AFIDOS
13

15. Estrategias
• Mejoramiento tradicional
• Mejoramiento asistido por marcadores
MAS
• Tecnología de Post cosecha
• Mutaciones inducidas por metodos
químicos y físicos
• Ingeniería Genética

16. Fases de desarrollo de plantas
transgenicas
Gene Discovery
Laboratorio
Transformacion Cultivo de tejidos
Invernadero
Campo
Comercializacion

17. Tecnología de papaya transgénica
Silenciamiento génico : gen RNA proteína
DNA RNA evitando la expresión del gen (SGT)
RNA proteína
evitando que sea traducido (SGPT)
17

18. Silenciamiento a nivel del RNA
• dsRNA formación de RNAs pequeños
• este proceso se encuentra altamente conservado a
lo largo de la evolución.
ANIMALES: RNA de interferencia (RNAi)
HONGOS: “quelling”
PLANTAS: silenciamiento génico post-transcripcional
(PTGS)
18

19. Uso del silenciamiento del ARN
para la resistencia a virus
•La generación de construcciones de ARNdh son muy
eficientes en la inducción de silenciamiento del ARN
Secuencia viral
Secuencia viral
Promotor Intron Terminador
90-100% plantas resistentes
19

20. MODELO DE SILENCIAMIENTO GENICO
POST_TRANSCRIPCIONAL VIRUS
ssRNA
Silenciamiento
del virus
Defensa
20

21. MODELO DE SILENCIAMIENTO GENICO
POST_TRANSCRIPCIONAL
21

22. Colecta de material de papayo contaminados
con PRSV en Junín

23. Madre mía
La Unión Colecta de material de papayo
infectados con PRSV en
Tulumayo Sutulluy
distintas localidades:
Chinchaivito
Región San Martín: la Unión y
Madre Mía
Región Huánuco: Tulumayo y
Chinchaivito
Región Ucayali: Sutulluy

24. Colecta de Material Infectado con el Virus PRSV
en Región Huánuco y San Martín

25. Mantenimiento en invernadero de plantas infestadas
con virus y aislamiento de variantes virales de PRSV

26. INFECCION MECANICA
PAPAYA CORTE DE HOJA PLANTA LIBRE DE VIRUS REALIZANDO
INFECTADA INFECTADA PEQUEÑAS LESIONES LOCALES
INFECCION DIRECTA
TAMPON FOSFATO EXTRACTO DEL VIRUS

27. EVALUACION DE LOS PLANTONES DE
PAPAYO INFECTADOS

28. EXTRACCION DE ARN A PARTIR DE
HOJAS INFECTADAS
CORTE DE HOJAS INFECTADAS
PLANTON DE PAPAYO
INFECTADO CON EL VIRUS
PRSV
ALMACENAMIENTO EN NITROGENO
LIQUIDO

29. MORTEROS PRE COLOCACION DE LAS
MUESTRAS TRAIDAS DE
ENFRIADOS MUESTRAS EN MORTERO
INVERNADERO EN N2
LIQUIDO
TUBOS CON BUFFER
DE EXTRACCION
POLVO FINO DEL TEJIDO
AGREGANDO N2 LIQUIDO A TRITURADO
LAS MUETRAS
TRITURACIÓN DEL
TEJIDO VEGETAL

30. CALIDAD DE ARN TOTAL A PARTIR DE
HOJAS DE PLANTAS DE PAPAYO
INFECTADAS CON PRSV
28S RNAr
18S RNAr
ELECTROFORESIS EN GEL DE AGAROSA
AL 1%

31. Reacción de PCR
31

32. SINTESIS DE ADN COMPLEMENTARIO (ADNc)
Y AMPLIFICACION POR PCR DE LA PROTEINA
DE CUBIERTA
1.2kpb

33. Secuencia de la proteína de cubierta del PRSV (NCBI)

34. FORMATO DE MACROGEN PARA SECUENCIAMIENTO
Custom primers sent along with DNA samples.
Conc.(pmole/ul
Name Sequence Tm value
)
REP4 5´ GCTTCCGGAGCATCGATTGGAGCG 3´ 10 52
MB12A 5´ GACTCAACAAACACACAAGCGCA 3´ 10 52
Reaction Information 1
Total 42 sequencing reactions were ordered.
# Sample Name Name of Seq primer PCR Primers (F/R) DNA conc. (ng/ul)
1 CP010202 REP4 Leave blank if no PCR 30
2 CP010202 MB12A Leave blank if no PCR 30
3 CP010204 REP4 Leave blank if no PCR 18
4 CP010204 MB12A Leave blank if no PCR 18
5 CP020102 REP4 Leave blank if no PCR 18
6 CP020102 MB12A Leave blank if no PCR 18
7 CP010308 REP4 Leave blank if no PCR 18
8 CP010308 MB12A Leave blank if no PCR 18
9 CP020506 REP4 Leave blank if no PCR 18
10 CP020506 MB12A Leave blank if no PCR 18
11 CP020105 REP4 Leave blank if no PCR 15
12 CP020105 MB12A Leave blank if no PCR 15
13 CP010106 REP4 Leave blank if no PCR 15
14 CP010106 MB12A Leave blank if no PCR 15

35. CROMATOGRAMAS DE SECUENCIAS VIRALES

36. SECUENCIAS COMPLETAS DE
LA PROTEINA DE CUBIERTA
DE PRSV OBTENIDAS

37. ANÁLISIS POR BLAST DE LA SECUENCIA DE
AMINOACIDOS A PARTIR DE LA SECUENCIA
NUCLEOTIDICA CP010308

38. Secuenciamiento y análisis Filogenético
de las razas virales
63 CP020204
52 CP020404
Región
43
CP020101 Huánuco y San M
Huánuco y
100 San Martín
CP020105
CP020102
CP010104
CP010202
CP010204
Junín
Región Junín
72
80 CP010308
0.002

39. 27
Mexico
29 99
53 Thailandia
China
3
Venezuela
2 17
Thailandia
45
98
Perú 99
99 99 Indonesia
52 Mexico 84 Thailandia
0
079 Florida USA 76
4 3 Thailandia
Taiwan
0 99 Thailandia
Mexico 0 99
13 China
Mexico 4 98
Vietnam
75 Australia 10
11471 Vietnam
01 Mexico 9 28
Vietnam
Jamaica 99 96
Florida USA América 2 37
Filipinas
0
1
35 Mexico 71 37
43 China
Vietnam Asia
99 13
Florida USA Thailandia
0 9
9 Cuba Vietnam
99 10
Venezuela Japon
1 99 6
Mexico 15 Thailandia
6399 2
24
Venezuela Vietnam
0 31
35 Vietnam- China
Brasil 21
58 1
4 79 15
Taiwan - Malasia
91 China
94 Vietnam
India 7
27
Mexico Vietnam
29 99 99
53 Thailandia 84
China
India
17 60 Sri Lanka
Thailandia India
45
98 99
99 India
Indonesia 99
Pakistan
0 84 Thailandia
76 India
Thailandia

42. Se realizó el diseño final del
constructo utilizando el
programa Vector NTI 10® de
invitrogen (Figura N°2), en las
cuales incluía los fragmentos
de interés, los sitios de corte
enzimático y el tamaño total
del plásmido, que resulto ser
de 9,724 pares de base.
Este diseño y la construcción
virtual del plásmido fueron
muy importantes para el
desarrollo físico del constructo

43. Todas las extracciones de ADN plasmídico fueron realizadas utilizando el
kit comercial de promega Wizard ® plus SV Minipreps DNA Purification
System y resuspendidas en 50ul de agua libre de nucleasa.

46. Transformación genética

49. Transformación bacteriana y análisis de plásmidos quiméricos
 Se han ligado las
secuencias de interés en
un vector comercial de
clonamiento pGEM-T
Bacteria E. coli dH5α
 El INIA cuenta con un equipo
Electroporador, que se esta utilizando para
Incorporar las secuencias de interés en un vector

50.  Actualmente ya se tiene una lista de los vectores y fragmentos que nos
proporcionaría el CIP:
• Vector pCAMBIA 2305.1
• Vector pCAMBIA 1305.1
• pCIP92
• pCIP90
• pCIP41

51. Aislamiento por PCR (Reacción en cadena de la Polimerasa)
 Se han estandarizado las condiciones para obtener los fragmentos
de interés mediante la amplificación por PCR con secuencias
especificas; además se cuenta con técnicas de purificación a partir de
geles de agarosa.
Producto amplificado por PCR
Producto purificado a partir de
un gel de agarosa

52.  Además se cuenta con un cepario criopreservado a -70ºC de
los plasmídos utilizados para las actividades de transformación
genética.
El Analizador genético adquirido por el
CNBAF, permitió el secuenciamiento
parcial del constructor pINIA001
Incubadora con shaker para
cultivos bacterianos

53. In vitro
Se cuenta con un protocolo de medio de micropropagación de
plántulas de papayo in vitro.

54. Propagación del material vegetal
 Se cuenta con la variedad de papayo
PTM311 susceptibles al PRSV.
 Mediante un acuerdo con el IIAP se
realizó la transferencia del material vegetal
para su uso con fines de investigación.
Plántulas de papayo micropropagadas
Cuarto de propagación con condiciones
Plántulas de papayo regeneradas optimas para la regeneración del material
vegetal

55. Germinación de semillas de papayo
 Se ha establecido un
protocolo de desinfección de
semillas para ser
introducidas in vitro.
 Se tiene un medio de
germinación in vitro.
 Las plántulas obtenidas
son utilizadas para la
transformación genética
Semillas germinadas
Cámara germinadora
después de 3 semanas
de introducidas

56. C3.- Desarrollar metodologías para la producción
de plantas de papayo resistentes al PRSV.
 Se están desarrollando eventos de transformación con
el gen GUS en hojas de papayo para estandarizar la
metodología de trabajo.

57. Transformación genética con el constructo
pINI001 en Papaya
La transformación
genética fue
mediada por A.
tumefaciens
Medio de regeneración
Medio selectivo de
regeneración de embriones

58. C4.- Elaborar protocolos de bioseguridad para la
experimentación en la producción de plantas de papaya
 Se realizó un taller con
especialistas de diferentes
instituciones a nivel
nacional e internacional,
para elaborar protocolos de
bioseguridad en el caso de
papaya transgénica.
 Se tiene un informe
técnico de esta reunión, así
mismo se está a la espera
de la aprobación de las
“Normas internas de
seguridad de la
biotecnología del Instituto
Nacional de Innovación
Agraria”, producto del taller
Desarrollo de protocolos de bioseguridad en laboratorio,
invernadero y campo para la manipulación de plantas realizado.
transgénicas en el Perú

59.  Se ha incorporado el sexado de plantones de papayo con el fin de
incrementar las medidas de bioseguridad para evitar posibles escapes
mediante el flujo génico. Para lo cual se cuenta con secuencias
especificas que permiten seleccionar plántulas de papayo hembras, que
serán utilizadas en la transformación genética.
SDP2 – SDP3
M14 M15 M16 M17 M18 M19 M20
H/M H/M F F F H/M F
CFW – CRV U10 M1 M2 M3 M4 M5 M6
H/M H/M H/M F H/M F H/M
NAPF76 – NAPF77
U10 M1 M2 M3 M4 M5 M6
H/M H/M H/M F H/M F H/M
SDP1 –SDP2 M1 M2 M3 M4 M5 M6
H/M H/M F H/M F H/M
Blga. Yenny Aquino encargada de
realizar pruebas de determinación de
sexo en papayo

60.  Se ha remitido al Comité Interno de Bioseguridad del INIA los
protocolos y documentación solicitada para obtener la autorización de
trabajar con OVM´s en papayo.

61. Estandarización de protocolos para detección de
eventos transgénicos en papayo
Equipo de PCR en tiempo Real
 Se han establecido protocolos para la determinación de eventos transgénicos en
papaya.
 Así mismo una vez que se tenga la inserción del fragmento CP en el genoma de
la papaya, este será analizado utilizando sondas especificas.
 Para estos tipos de análisis el INIA cuanta con un equipo de PCR en tiempo
Real de ultima generación adquirido por el CNBAF

62. C5.- Fortalecimiento Institucional para el desarrollo
de ingeniería genética y la bioseguridad
 Capacitación en
bioinformática dirigida por
especialistas del CIP al
personal profesional del
INIA
Taller realizado en el CIP,
organizado por el proyecto
Papayo “Herramientas básicas
de bioinformática aplicada al
proyecto Papayo”

63. Infraestructura y equipos
 Se han adquirido equipos como la cámara de flujo vertical de
bioseguridad clase II, en donde se realiza actualmente los eventos
de transformación genética en papayo y en microorganismos como
E. coli y Agrobacterium thumefaciens.

64. Invernadero de Bioseguridad
 Actualmente se esta construyendo un
invernadero de bioseguridad, donde se
pondrán las plantas de papayos transgénicas
para su confinamiento y se realizaran las
pruebas de resistencia al virus PRSV.
Área para la construcción del
Invernadero de Bioseguridad

65. Equipos y kits comerciales adquiridos para el
proyecto papayo por intermedio del CIP.
Kits para
extracción y Mini centrifuga
purificación de
ácidos nucleicos
Adquisición de
Micropipetas

66. El Proceso de la Tecnología de la Papaya Transgénica

67. Conclusiones
Los protocolos para el desarrollo del constructo pINIA001 resultaron ser eficientes a un 99%. Por lo
que al final se logro obtener el constructo pINIA001, el cual fue verificado con pruebas moleculares
de PCR y con enzimas de restricción.
La desinfección de semillas con el protocolo establecido resulto ser óptimo para la eliminación de
Hongos y bacterias a un 80%.
El medio de germinación fue eficiente a un 60 %, pero se logro obtener buena cantidad de
explantes a partir de las semillas geminadas.
Los callos transformados se mantienen viables en medio selectivo con kanamicina por lo que se
deduce que en estos se encuentra por lo menos parte del gen de resistencia nptII. Se espera tener
la regeneración total y la propagación de la planta para poder realizar las pruebas moleculares.
La transformación genética en papayo con embriones somáticos, resulta ser un proceso largo, por
tal motivo los resultados de la inserción del transgen no se pueden determinar hasta la
regeneración del callo.
Los primers y protocolos de PCR que fueron utilizados para verificar la inserción de los fragmentos
en el constructo, también son viables para la verificación de la inserción del transgen en los
explantes de papayo transformados.