© MSH WorldWide 2016 All Right Reserved.

1. INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL
CENTRO DE DESARROLLO DE PRODUCTOS BIÓTICOS
“EVALUACIÓN DE LAS CEPAS AISLADAS DE BACILLUS DEL FILOPLANO DE LAS
SOLANÁCEAS PARA EL CONTROL BIOLÓGICO DE ALTERNARIA EL TIZÓN
TEMPRANO DEL TOMATE”.
Marcelo Santiago Hernández

2. INTRODUCCIÓN
Tizón Temprano del Tomate
Alternaria alternata
Filoplano: Microambiente en la superficie de una hoja.
PERDIDAS ECONÓMICAS
DAÑOS
Filoplano

3. AGENTES DE CONTROL BIOLOGICO
Genero: Bacillus
Gram+
COMBATE
B. Subtilis
B. Amyloliquefaciens
B. Lincheniformis
B. pumilus
OBJETIVO
Aislar y caracterizar nuevas cepas de bacterias formadoras de esporas
resistentes al calor del filoplano de las solanáceas y seleccionar aquellos que
Controlen a Alternaria alternata.

4. MATERIALES Y MÉTODOS
Aislamiento de bacterias del filoplano solanáceas
Se recolectaron trozos de hojas (5 g) Italia, lavaron
durante 1 h. Se centrifugaron 50 ml de la suspensión
10 min, se calentaron a 90 °C para 10 min y posterior
se inocularon en agar nutritivo.

5. Caracterización fisiológica, morfológica y molecular de las
bacterias
93 cepas de bacterias
aisladas de filoplano20 cepas activas
Caracterizan por sus rasgos morfológicos y fisiológicos. 4 cepas como
bioensayo, identificadas por 16S-rRNA secuenciación parcial del gen como
bacillus.
Control de Alternaria alternata

6. La evaluación cuantitativa de la actividad antagónica de las cepas
bacterianas
El crecimiento activo al centro de una placa PDA Petri (90 ml), en el que se
sembraron en cultivos puros de cepas bacterianas alrededor del borde.
Las placas inoculadas donde por triplicado y se incubaron a 25 °C. El
diámetro de los micelios se midió diariamente.
El porcentaje de inhibición del crecimiento de hongos debido a la actividad
antagónica.

7. Control Biologico de Alternaria enfermedad del tomate
1 de edad, las plantas de tomate (Solanum lycopersicum L. cv. Cor-Barino) se
utilizaron para probar la capacidad de las bacterias para controlar, in vivo,
Alternaria en medios de PDA, se utilizó para producir el inóculo mediante la
recopilación de conidios conídia en una suspensión de agua.
Dos ensayos de control biológico separadas se llevaron a cabo, con el fin de
estudiar el efecto de la velocidad y el momento de aplicación de los
antagonistas en el control de la enfermedad, 1ra inoculación de una gota (5
ml) de una suspensión bacteriana, 2da se realizaron por pipeteo una gota (5
ml) de las bacterias en suspensión .

8. Identificación molecular de los candidatos ACB
Las cepas antagonistas confirmadas en los bioensayos seleccionados fueron
identificados por 16S rRNA secuenciación y análisis de fragmentos de genes.
La secuencia del gen parcial se amplificó y se secuenció usando el 16SF
cebador 50-AGTTTGATCCTGGCTCAG-30 y el cebador inverso 16SR 50-
TACCTTGTTACGACTTCACCCCA-30, añadido (0,2 mm cada uno) a una
mezcla que contiene 50 gr de ADN, 1,5 ml de MgCl2 , 200 ml de dNTPs y 1
U de Taq ADN polimerasa.

9. La producción de la enzima constitutiva de las cepas aisladas de control
biológico
La producción de la enzima se determinó mediante la prueba de API-ZYM.
El perfil enzimático de las bacterias se llevó a cabo mediante pruebas de 19
ensayos de actividad enzimática por la coloración de la suspensión.
Los microorganismos se cultivaron durante 24 h en placas de agar nutriente
a 30 °C. Tres tiras de cada muestra se inocularon y, a continuación, se
incubaron a 37 °C para 4 h y al final de la incubación, los reactivos ZYM A y
B ZYM.

10. La intensidad de los colores evaluados en una escala de 1-5 permitió
diferenciación entre positivo (3-5) y (1-2) la producción negativo de cada
enzima específica.
Observaciones al microscopio óptico
Los efectos de la interacción bacteriana antagónica sobre conidios germinación
y la morfología de las hifas de A. alternata se visualizaron por microscopía de
Luz donde se observo cada cepa bacteriana antagónica.

11. Análisis de los datos
Los datos sobre los efectos de los antagonistas en el crecimiento de la control
de patógenos y la enfermedad se sometieron a análisis de una vía de la
varianza (ANOVA) y las separaciones medias se realizaron por la prueba de
rangos múltiples de Duncan. Las diferencias a P <0,05 se consideró
significativo.

12. RESULTADOS
La selección de las cepas y la selección de los candidatos ACB
Los resultados de un desafío placa cualitativa anterior revelaron un total de 20
cepas Gram-positivas que presentan actividad antibiótica contra el patógeno
siendo probada (Tabla 1).
Caracterización fisiológica mostró que 6 de ellos fueron capaces de inhibir el
crecimiento de hongos mediante la secreción de compuestos volátiles, mientras
que sólo 3 cepas producen sustancias sideróforos similares.

14. En la evaluación de antagonismo in vivo
Efecto de la tasa de aplicación
Las cuatro cepas bacterianas reveló
una importante capacidad de control
biológico de Alternaria tizón
temprano del tomate de acuerdo
con su concentración.

15. Efecto del tiempo de aplicación
Las cepas de control biológico
mostraron la mayor actividad
cuando se aplicaron al mismo
tiempo del patógeno en tanto
replicar experimentos.

16. Fueron identificados por amplificación del gen 16S rRNA. Las secuencias
parciales relativas para cada cepa se determinaron, depositado en GenBank y
en comparación con los que ya están en la base de datos mediante la
ejecución de BLAST.
La alineación indicó que las cuatro secuencias que coincidan con el más
cercano (99%) con otras secuencias parciales de genes 16S rRNA SEV-ral de
cepas bacterianas, pertenecían al género Bacillus.

17. Las actividades enzimáticas
análisis de la API-ZYM mostró que cada cepa de Bacillus como control
biológico posee un patrón típico enzimática bajo condiciones de ensayo.
Las cepas mostraron una reacción positiva por leucina y al acido fosfático.

18. Evaluación morfológica de las estructuras fúngicas antagonizadas
Las observaciones microscópicas luz
revelada que la co-cultivo de las
bacterias con el hongo, anormalidades
morfológicas en las estructuras en
germinación y se indujeron hifas (Fig. 5).
Las cuatro cepas de hongos producen
daños similares.

19. DISCUSIÓN
El presente trabajo identificado nueva Bacillus efectiva cepas capaces para
controlar el tizón temprano del tomate. Género Bacillus pueden ser
considerados como un importante reservorio de antagonistas para su uso en la
supresión de enfermedades de las plantas, también fueron capaces de
antagonizar los micelios y el desarrollo patogénico de A. alternata, que
fueron aisladas de la superficie de las hojas.
El análisis filogenético supuestamente ellos relacionado con diferentes
especies de Bacillus, incluyendo B. amyloliquefaciens y B. thuringiensis que
se encuentran entre los más frecuentemente implicados en el control
biológico de enfermedades de las plantas.

20. Los efectos protectores de Bacillus ACB pueden basarse en mecanismos de
diferentes para antagonizar directamente el crecimiento de patógenos
mediante la liberación de una variedad de metabolitos antifúngicos
bioactivos potencialmente implicados en antibiosis, incluyendo proteínas,
lipopéptidos, antibióticos difusibles, compuestos volátiles.
Las cepas de Bacillus seleccionadas demostraron una actividad inhibidora
sobre el micelio de A. alternata crecimiento en ensayos de placa, también lo
que sugiere que ciertos compuestos volátiles pueden estar implicados en el
nivel microambiente.

21. También se encontró que las cepas de control biológico 3F-II, 3F-VII y 13F-III
para producir sideróforos, ligandos de unión a hierro no proteicos que
secuestran el hierro del microambiente, que pueden ser importantes en la
supresión de las enfermedades fúngicas.
Los sideróforos pueden ser factores de competitividad en condiciones de
deficiencia de hierro, tales como los de la superficie de la hoja.