5 genómica funcional análisis de proteínas aspectos básicos y trucos by wulff
1. Genómica funcional análisis de
proteínas aspectos básicos y
trucos by wulff
Proteomica es degenerada cuando hablamos del análisis de las proteínas. Es
una disciplina dentro de la genómica funcional. Por eso el titulo de nuestra
clase.
Para tener un aspecto histórico general de cómo nacen estas técnicas,
hablaremos de cosas bien básicas de cómo nacen estas técnicas. Todos son
conceptos de la biotecnología.
Ahora la biotecnología es algo que nació intrincadamente con los inicios de
las primeras civilizaciones, mejoramiento genético de especies para obtener
mejores alimentos, Descubrimientos como la fermentación que de una forma
genero la producción de pan y cerveza, en el transcurso de 4mil a 5 mil años
han ocurridos eventos que permiten hacer una filosofía, con personajes y
conocimiento científico que se genera del siglo 18 al siglo 20. Después del siglo
20 hay otro salto cuántico que se refiere a la parte de industrialización del
conocimiento científico.
Ahora probablemente lo que ustedes vieron que en el siglo 17 y 18 estuvo la
ilustración, donde los filósofos partieron con el método científico. Y en el siglo
19 con la aplicación del método científico y Leenwenhoek permitió la
microbiología y evolución promoviendo la genética.
Actualmente es la bioquímica (química biología y física) que tiene como
misión realizar estudios relacionados con la purificación de proteína, análisis de
metabolitos, moldeamiento matemático usando pc etc. Etc.
Esto lo vemos hasta los años 80 y 90 analizar un gen proteína metabolito y su
función en la célula. Ese era el enfoque en la parte de análisis a nivel celular.
Ese era el análisis de datos.
Como hemos evolucionado, hemos visto en el transcurso de la historia al
menos 3 revoluciones industriales. La cuarta es la producción en masa y en
procesos de automatización. En la ciencia paso lo mismo por secuenciadores
automáticos, análisis de metabolitos generando perfiles metabólicos..
Llevando consigo el análisis de muchos genes y metabolitos al mismo tiempo a
gran escala.
Estrategias de análisis a gran escala.
Tenemos otro aspecto que es interesante. Hay una evolución en la historia de
la genómica. En la diapo se observa que el concepto de genética se hace en
el siglo 20, con fundamentos en Mendel. Lo más revolucionario fue la mezcla
de la genética con el análisis bioquímico y molecular. Haciendo secuencia de
ADN, llevando a las técnicas de clonamiento en 1972. Y al mismo tiempo
estudiaron en 1977 hacen el análisis de secuenciación
Uno de los más interesante en 1982 aparece la bioinformatica. Hay un último
punto muy interesante en todo el proceso.
Ustedes ya vieron replicación celular. El hombre lo usa en la biotecnología y
hay una técnica PCR que se usa en todas los proceso de la biología molecular.
Esto es el inicio del proyecto del genoma humano.
2. El proyecto del genoma humano ha recopilado toda la información genética
a nivel celular y de mitocondria, y lo más interesante por secuenciación se ha
visto cuantos pares de bases tiene (alrededor de 3mil mega bases) y en la
especie humana 22mil bases.
La metodología se comenzó en especie humana, luego de especies
homínidas cercanas, donde hay cerca de un 2% de diferencia con el hombre,
luego perros peces cebra, mosca de la fruta y bacterias con levaduras y
plantas.
Lo más interesante es que hay un gran problema. Dijimos llegamos a un punto
donde tenemos toda la información. Pero en realidad no es así. Porque de una
u otra forma se genera nuevas preguntas, porque la información que esta a
nivel de ADN solo es información pero tenemos que hacer echar a andar el
dogma de la biología molecular., proceso de ADN que se replica y hay
transcripción y traducción a proteína.
Con la secuenciación solo vemos la primera parte de la temática en el estudio
de la célula, sin embargo queda como la maquinaria de la información que
está en el núcleo esta organizándose de tal manera que hace una función, y
estructura algo complejo como la célula.
De alguna u otra forma se habla de cuáles son las interacciones de genes
proteínas y metabolitos dentro de la célula
.
Como saben el concepto de genoma en un punto de vista macro,
interacciona con todo el ambiente. Como ya saben la célula es un sistema
termodinámico abierto. Con intercambio de masa energía e información con
factores ambientales o los que interactúan con la célula.
Hay fenómenos de respuestas de adaptación con mecanismo de defensa y
climatización.
Dogma de la bioquímica
Si ustedes lo ven, es como un tren de eventos de forma espacial y temporal.
Pero al lado hay una figura como los eventos de estimulo afecta la traducción
y transcripción. Como los fenómenos de transcripción traducción y control a
nivel de actividad proteica.
Todo eso lo extrapolaremos en la parte de la bioquímica que lo veremos
después.
Tipos de genómica, la genómica es una disciplina que tiene como objetivo
principal comprender los genes de la célula.
La genómica se puede dividir en 3 disciplinas claras.
Estructural secuencia de ADN haciendo mapas genéticos físicos o de
recombinación,.
genómica comparativa que lo que hace es un estudio a nivel evolutivo,
que pasa con el gen en distintas especies con su función e importancia
celular con su filogenética hablando de estudios de evolución
molecular.
La genómica funcional la podemos dividir en 3 disciplinas de acuerdo al
concepto
trasncriptomica enfocado como ocurren los cambios en la transcripción
celular.
3. Después la Proteomica estudiaremos que ocurre con el fenómeno de la
traducción y otros eventos de las proteínas.
Y finalmente la
Metabolomica que es, como proteínas que son enzimas y estructurales.
Las que son enzimáticas generan productos de bajo peso molecular
que son metabolitos. Dependiendo de la condición veremos los niveles
de modificación de las sustancias a nivel intracelular como esta afecta
la célula en el medio externo.
De una u otra forma la información que se obtiene de la genómica estructural
comparativa y funcional se recopila en la parte de informática de información
y organización, para posteriormente manejarla.
Lo más interesante y la nueva revolución es que ya no se necesita un
laboratorio complejo para hacer biología. Sino que solo hacerlo en
computador. Luego herramientas de software modelamiento e interpretación
a nivel celular.
El concepto para comprender como estamos viendo modificaciones en la
modificación de genes, tenemos que hacer un diseño experimental. Haciendo
análisis comparativo entre controles e individuos expuestos a condiciones
extremas o mutaciones.
Normalmente es lo que uno hace es un experimento en paralelo estudio de un
control donde se le trata bien, como en las plantas y al mismo tiempo tenemos
un tratamiento o mutante, posteriormente se recolectan las muestras para
realizar extracción ya sea de RNA mensajero proteína o metabolitos, para
detectarlos y obtener resultados. Al tenerlos evaluamos describimos y
obtenemos una conclusión. Eso es cómo funciona la Proteomica
metobolomica y transcriptomica.
No es algo nuevo sino que se ha realizado a través de 200 a 300 años donde
uno siempre busca la sustancia que busca tan efecto en tal cosa etc etc.
Pero ahora lo que hacemos es usar la automatización que las llamamos las
“omics” que hacen el estudio de RNA mensajero proteína y metabolito.
La clase de ahora está enfocada a la parte final del proceso de los eventos de
estudio de la transcripción y del análisis del genoma y eso es la Proteomica
Que es la combinación de 2 palabras como “proteína expresas por el
genoma”
Analiza las proteínas pero también realiza el estudio de interacciones proteína-
proteína y modificaciones de proteínas por un factor determinado en el
organismo.
Hay 2 tipos de Proteomica la estructural relacionada con análisis y evaluar la
estructura de la proteína, haciendo estudio a nivel primario segundario o
terciario de la proteína, llegando al cuaternario para ver cómo interactúan las
proteínas como forman una macromolécula como un complejo proteína o las
ATPasas.
Y también haremos un estudio a nivel funcional, utilizando enfoque
experimental de enfoque global que buscaremos el gen que se expresa bajo
condición determinada.
4. Que tipo de eventos se analizan en la Proteomica, es la parte estructural
análisis en 3D, con la utilización de técnica con resonancia magnética nuclear
y espectrometría de masa. El diseño experimental que les mostré en el caso de
Proteomica se utiliza para ver niveles de expresión de proteínas modificaciones
posterior modificaciones fosforilacion splising alternativo, las proteínas igual
hacen splicing, y además veremos el fenómeno de interacción de proteína.
Ahora. Les are un recordatorio de parte de proteínas.
Ahora comprenderemos como se utilizan los conocimientos básicos con
referencia al análisis de esta estructura.
Estructuras de proteínas. Enlace peptidico con el primer nivel, el segundo nivel
es por interacciones de estos aminoácidos. Interacciones por enlaces. Etc.
Interacción ion ion-ion dipolo interacciones
hidrofobicas y enlaces covalentes. Eso lo
observaremos en las proteínas, la
formación de esas estructuras que son de
alfa hélice y sabana plegada B , son por
puentes de hidrogeno, son entre grupos
carbonilo y anilido de los enlaces peptidico
de la cadena lineal.
De alguna forma cuando se forma la
estructura dentro de la cadena se hace un
torque que forma esas estructuras o un
entretejido de la proteína que por ejemplo
1 sola de la cadena hace un loop hace
interacción de enlace péptido generando
puentes de hidrogeno,.
Las interacciones o estructuras segundarias
hay cadenas residuales de los
aminoácidos, (recordar que son) R es el
radical externo que tiene características
como polar o apolares y con los polares
hay con carga con y sin carga con los
neutros.
Normalmente en alfa hélice y sabana plegada, las cadenas R quedan
expuestas, mirando hacia afuera. El acido aspartico de la sabana beta
interactuara con la lisina de la alfa hélice y se forma la estructura terciaria.
Principalmente se ven con interacción ion ion-ion dipolo y puente de
hidrogeno.
Hay aminoácidos altamente polares como la fenilinialina triptofano cadenas
aromáticas, leucina y todas esas crean grupos R, que si se fijan tienen una
particularidad que interactúan con interacciones hidrofobicas.
Esas interacciones hidrofobicas las vemos dentro de la célula. La organización
y estructura de las proteínas es por un concepto termodinámico.
Normalmente la organización de la proteína es para reducir la entropía del
sistema.
Normalmente los aminoácidos apolares se orientan hacia el núcleo de la
proteína mientras que los polares están más superficiales teniendo la
capacidad de ser solubles en agua.
5. El enlace covalente
es por medio de
enlaces puentes di
sulfuro.
En los aminoácidos
están los tioles .
cisteina, RER PDI ,
proteínas
relacionadas con la
formación de los
doble enlaces para
estabilizar el sistema
termodinámico con
tendencia a reducir
su entropía.
Las proteínas hay intrínsecas o integradas con aminoácidos apolares dentro de
la membrana forman estructuras segundarias de alfa hélice.
La formación de la integración forma estructuras
más complejas a nivel celular.
Las proteínas no solo pueden están embebidas
dentro de la membrana
Sino que hay otras asociadas.
Ferredoxina, que permite el transporte de
electrones a través de la membrana, no es
integrada es asociada dependiendo del estado
electrónico que tenga interactúa con las demás
proteínas. Vemos otros tipos de proteínas con un
anclaje de lípido. GTPasas proteína G. traducción
de señales.
6. Si ustedes se fijan todas las proteínas tienen
funciones, sus características están
relacionadas con su función. Leucin zippers.
En que proteínas hay leucin zipper.
RNA polimerasa II evento de la activación
de la RNA está por alfa hélice con 2
dominios uno con interacción de 2 proteínas,
cierre de leucina yal mismo tiempo una zona
en la cual interactúa con el ADN y esa
asociación y unión con el ADN permite la
activación del proceso de transcripción.
Propiedades de las proteínas.
Eventos de fosforilacion, quinasas en traducción de señales con map quinasas
Todo ese tipo de cosas tienen otro evento en el estudio de la Proteomica que
tienen que comprender que es la fosforilacion y desfoforilacion.
Función a nivel celular evento de transducción de señales hay cascadas de
fosforilacion tienen 2 funciones, una el proceso de llevar la información de
membrana plasmática a núcleo para producir la activación de un factor de
transcripción, pero la gracia de la fosforilacion celular, es una que permite la
amplificación de la señal y la otra que se decepciona a nivel de membrana
plasmática se lleva a citoplasma donde hay activación o inhibición de vías
metabólicas.
7. En bioquímicas verán que algunas proteínas de glicolisis están relacionadas
activando o desactivando dependiendo de la fosforilacion de las enzimas.
El caso claro es la exoquinasa. Cuando se activa desfosforilada. Evento celular
intentando un balance de ATP y ADP. Desfoforilacion de la exoquinasa,.
Modificaciones posteriores tradicionales. En la hemoglobina hay un complejo
de amadori que son glicosilada, en diabetes II ,de por si un indicar de la
patología de diabetes adulta es la cantidad de hemoglobina glicosilada en la
sangre.
Dentro de todo lo que vimos en las funciones de las proteínas son las uniones a
ligando catálisis y regulaciones y estructuras que se basa en la estructura y
funcionalidad de las proteínas.
Para comprender la Proteomica, veremos que la base o el poder comprender
la parte proteica ,es bastante clave para establecer bases o fundamentos de
trastornos que pueden afectar a las personas.
Tiene que saber que hay enfermedades que si cambia 1 sola proteína deja la
escoba en el individuo.
Los bioquímicos toman muestras de proteína y hacen pruebas, viendo su
hidrofobisidad etc. Y un efecto de carga eléctrica, tamaño, con estudios de
interacción de otras proteínas modificaciones post-traduccionales actividades
enzimáticas y función estructuras. Esas son las bases para hacer un análisis de
proteína.
Entendiendo estos conceptos ya podemos hacer el modelamiento y análisis
de cambios en la composición de proteínas a nivel celular.
Modificaciones Posterior-traduccional: normalmente pueden ser de varios
tipos, las básicas son la glicosilacion de proteínas de membrana. Después el
caso de fosforilacion, después adición de cadenas lipidicas que permite el
anclaje de las proteínas en las membranas biológicas. No solo está
relacionado concambio de proteína sino en su activación o desactivación
para su función en la vía metabólica.
Para poder a empezar con el análisis de proteínas hay que purificar. El
concepto, es obtener la esencia de la sustancia.
Cuando hacemos el análisis de una proteína tenemos que estudiar o ver qué
métodos utilizar. Como ustedes ven hay una gran complejidad de proteínas
con distintas funciones, de una u otra forma para la funcionalidad de la
proteína se busca una metodología especifica, que las metodología de
purificación de proteína se basan a las propiedades físicas y químicas de las
proteínas como tamaño carga peso etc.
8. Cuáles son los métodos que comúnmente se utilizan para la purificación?
Hay métodos físicos como la centrifuga que separa proteína
por su masa. Se aplica fuerza que separa las proteínas por
masa.
Hay otras técnicas como separación de bases estacionarias
y móviles como la cromatografía.
Intercambio iónico cuando nosotros tenemos un ligando y la
fase estacionaria el ligando se une al punto isoeléctrico a la
matriz estacionaria, (ligando) cuando cambiamos el rango
de pH y el cambio del isoeléctrico hacemos que se separe la
matriz.
Afinidad se hacen con proteína especifica, anticuerpos y el
anticuerpo del conejo del humano es ligada a la matriz
hacemos un extracto de planta y para eso utilizamos que
reconozca la anticuerpo de humano la de la planta
Cuando hay anticuerpo se diseñan en base a otra especie. Y
esa especie es como método para unir una proteína que no
conocemos en otro sistema. Eso es reacciones cruzada,.
Utilizando anticuerpo especifico.
Las proteínas en la evolución tienen zonas que son comunes, proteína de
humano el citocromo C transporte de electrones en membrana, se caracteriza
porque esta de ameba hasta humano, tiene zonas conservadas podemos
hacer anticuerpos para que reconozca esa zona concertaba y así realizar la
separación
También hay métodos químicos para hacer la separación de proteínas que
hay uno que se base en el salting in salting out.
Normalmente las proteínas tienen una capa y
cuando agregamos sal aislamos a la proteína en
relación con su capa de solubilidad. Esa capa tiene
un punto isoeléctrico igual a cero y así interactúa
con otras proteínas de igual punto isoeléctrico
generando su precipitado.
9. Sal hasta que el pH hace que elimina la esfera de solubilidad. Interactuando
con proteínas iguales.
El punto isoeléctrico es el equilibrio de cargas de la proteína externa de la
proteína. Cuando es 0 es insoluble y precipita.
Cuando uno ha hecho el aislamiento de proteínas hace la cuantificación y
análisis de proteína con técnicas espectrofotométricas. Que se utiliza para
muchos estudios, es la utilización de las
distintas capacidades de luz para medir la
sustancia en una solución. Resumido en
eso. Normalmente cada sustancia tiene la
particularidad absorber distintas longitudes
de ondas dentro del espectro visible y la
uv . Hay un monocromador que es un
prisma que hace una luz blanca en
espectro visible de luz. La gracia es que
uno selecciona una longitud de onda y lo
hace pasar por la sustancia y detecto.
Las formas que hacemos la extracción de proteína lo hacemos con
cuantitativo como la espectrofotometría.
La separación de proteína por electroforesis. Lo más interesante es que se ha
encontrado relación entre carga y masa.
También se ve en ADN. La técnica de
electroforesis se puede hacer en proteína, para
una mezcla compleja de varias proteínas.
Técnica de electroforesis es técnica analítica
instrumental separando moléculas complejas
por sus propiedades fisicoquímicas carga
eléctrica y masa molecular Requiere matriz
polimérica permitiendo la separación de las
moléculas por masa y peso molecular.
Una fuente de energía eléctrica que permite la
generación de una diferencia de potencia
eléctrica que favorece la separación de
moléculas cargadas.
Cuando hacemos un gel de poliacrilamida, cuando aplicamos el campo
eléctrico hacemos separación de carga y masa, el gel de poliacrilamida en
condición desnaturante hace que la estructura terciaria se linealisa, actúan
dos sustancia metamercaptoetanol. Y el buffer tenia un detergente SDS la
gracia es que la linealizacion con el SDS y el betamercaptoetanol que rompe
el puente de sulfuro y después el SDS le da carga negation. En la electroforesis
corren de negativo a positivo, por el SDS. Haciendo la separación entre la
longitud de la cadena simple y la cantidad de moléculas de SDS. Si hay una
cadena corta es de menor masa molecular. La gracia de la matriz entre mas
poliacrilamida es más fino.
10. Tipos de electroforesis. Serán varios, en condiciones no denaturantes, tomando
las proteínas y midiendo su actividad enzimática. Hay otra metodología que es
la electroforesis en 2 dimensiones. Donde hay 2 propiedades intrínsecas, punto
isoeléctrico y la masa. Como hacemos una separación en 2d. La primera
etapa se separan proteínas por su punto isoeléctrico., por isoelectroenfoque.
Donde utilizamos un sistema que se llama isoelectronfoque que puede ser
vertical u horizontal, que ha variado mucho. La más moderna es donde uno
pone una especie de cinta en un receptáculo y luego la muestra, donde se
aplica electricidad, y en la matriz polimérica envase poliaa tiene anfolitos. Que
permiten generar un gradiente de pH. La gracia es que el gradiente causa
que las proteínas migren y se mueven por la banda y se separen por el rango
de pH, relacionado con el punto isoeléctrico de cada proteína.
Así de una muestra compleja podemos ver las proteínas de pH acido como
también las de pH alcalino, después de hacer hecho esa técnica uno realiza
la segunda etapa de la electroforesis,. Que es la vil y vulgar electroforesis en
condiciones denatuantes.
Pasos de electroforesis en dos dimensiones usado en genómica funcional
comparativa. Condición A control y B tratamiento, extraemos las proteínas de
ambas y posteriormente hacemos la evaluación cuantitativa de expresión de
la proteína,. Como saben podemos tomar la muestra souubisasa en buffer
para realizar el isoelectronfoque. Dando de control como del estudio que
estamos haciendo se hacen en paralelo,. Después tenemos las proteínas
separadas por tango de pH. Posteriormente tomamos esa muestra que ya son
separadas por punto isoeléctrico, y lo ponemos en geles de poliacrilamida
para separarlos por peso molecular. Hacemos eso en paralelo uno control,.
Después aplicamos método de tinción con azul de cumicie sales de platas
auto radiografía o fluorerencia, esa condición con respecto al control y el b
con respecto al otro control, si no se fijan en una dimensión son como bandas,
pero en 2d se verán puntitos, que ahí se usa la informática con análisis de
imagen que se ven el análisis de cambio de aparición o desaparición en cierto
gel según el tratamiento relación al control.
Entonces se corta el spot y se hace un análisis por espectrometría de masas.
Análisis de secuencias de péptidos obtenidos por digieren con tripsina.
Si tenemos el gel utilizamos una tijera y se corta la zona o secuencia del
tratamiento que estábamos estudiando y posteriormente hacemos un análisis
de Proteomica misma, tomamos la banda de un gel, hacemos tratamiento
con una proteasa. Tripsina, toma el gel la diluye y le agrega la tripsina que
genera fragmentos que son los péptidos (de menos peso molecular) esa
mezcla se utiliza para análisis de secuenciación, veremos que el análisis de
secuenciación antiguamente se realizaba por la secuenciación de EDMAN
que era hacer la degradación de proteínas por tripsinas y luego una
degradación química que se utiliza el reactivo de EDMAN y luego lectura
cromatografía. Con eso se sacaba la secuencia de la proteína de interés.
La limitante del sistema era desde el extremo aminoterminal, (donde se inicia
el proceso de traducción)
la situación es la siguiente,
esa metodología no
permitía leer mas allá de 20
11. aminoácidos desde el inicio del aminoterminal,
Y usaron espectrometría de masa, el método pequeño solo podríamos leer un
pequeño fragmento de la proteína pero con la espectrometría de masa es
algo interesante porque hay moléculas diluidas en solución que las pasamos a
fase gaseosa y luego las bombardeamos de fase gaseosa y luego en
condición de vacio se bombardea con electrones que son separados por
campos magnéticos (hace fragmentos) así determina la masa de esos
fragmentos que son cortados por la tripsina, además esos pequeños
fragmentos que están ahí podemos determinar la secuencia peptidica.
Podemos tener distintos fragmentos que podemos utilizar, así usamos y
podemos ver cuál es la proteína.
Para que tengáis una idea en un gel de 2 dimensiones donde se ve el control y
el tratamientos. Como con deficiencia de planta con azufre, en el análisis de
imágenes hay la aparición de una proteína que se diferencia con relación al
control y ahí se hace análisis con espectrometría de masa donde se ven
pequeñas letras, “cietear”, los aminoácidos se pueden codificar por 3 letras y
por 1. Cuando se hace eso solo se usa 1 letra.
Como se complementa o establece homología?
En esa secuencia la podemos empezare a utilizar para hacer una búsqueda
en la base de datos. NCBI/BLAST. Base de datos y podemos ver de forma
detallada. Podemos ver las características del gen, en la página respecto a
función y característica de la proteína. Del gen que se analizo por
espectrometría de masa.
Wwww.cbs.dtu.dk/services/netphos/ análisis bioinformatico netphos 2.0 server.
Tomamos secuencia de proteína con homología de la proteína que
estebamos estudiando y podemos ver eventos como la fosforilacion. Esa
secuencia que obtuvimos podemos hacer predicción de la fosforilacion de
una proteína. Con eso podemos saber donde está ocurriendo.