PCR Múltiple marcadores genéticos para detección rápída de infecciones oculares

1. PCR EN TIEMPO REAL DETECCIÓN DE
PATÓGENOS EN INFECCIONES OCULARES
Escuela de Optometría
Patricia Durán Ospina
Escuela de optometría

2. Investigative Ophthalmology and Visual Science Scimago Factor H: 183

3. Objetivo
Evaluar un Nuevo test PCR multiple para
detección simultánea de 24 patógenos en
infección ocular.
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4. Escuela de Optometría
El problema…..

5. Escuela de Optometría
Queratitis micóticas
Queratitis micóticas
Fusarium Penicillium
Alternaria Aspergillus

6. Escuela de Optometría
Fuente. Queratitis por Pseudomona. Durán, P. et al. Revista Chilena de Infectología 2008

7. Signos característicos de la infección por
Chlamydia trachomatis
Tracoma – Conjuntivitis de inclusión en el adulto
Escuela de Optometría

8. Signos característicos de la infección por
Adenovirus FFC o QCE
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9. Infecciones mixtas
Fusarium solani
Pseudomona aeruginosa
Adenovirus
CMV
Diagnóstico Rápido: PCR
PCR Múltiple: variante de la PCR tradicional dos o más loci se
amplifican simultáneamente en la misma reacción
Tradicional: Cultivos en medios de cultivo (más días, no
especie, mas costosa).
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10. Escuela de Optometría
Fast Track

11. Escuela de Optometría
Técnica PCR empleada
PCR reacción en cadena de la Polimerasa (Microsporidia, Propionibacterium acnés, Toxoplasma
gondii)
Uniplex, Multiplex
Panfungal PCR usando ITS demostró ser más sensible para diagnosticar hongos.
Usando primers de diferentes hongos es mayor que 18 S rDNA, 28S rDNA primers.

12. Escuela de Optometría
ITS - internal transcription spacer
El espaciador transcrito interno (ITS) Espacio del ADN
situado entre el ARN ribosómico subunidad pequeña
(rARN) y los genes de rARN de la subunidad grande en el
cromosoma o la región transcrita correspondiente en el
transcodificador policistrónico del ARNr precursor.

13. Escuela de Optometría
ITS - internal transcription spacer
En bacterias, ITS 1 está localizado en los genes 16S y 23S en el rRNA.
rARN es un componente de subunidad 30S de ribosomas procariontes
(Shine-Dalgarno). Short-Chain Dehydrogenases/Reductases “SDRS”.
Los genes que codifican: genes del 16 rRNA, y se utilizan para la reconstrucción
de filogenias.
Mientras que en eucariotes: existen dos: ITS1 e ITS2, en plantas está en la
fracción 18S y 5,8 S y en animales 28S
Ancestros genéticos……

14. Escuela de Optometría
http://iovs.arvojournals.org/article.aspx?articleid=2611258
Multiplex solid-phase strip PCR assay (referred to as strip PCR)
Extracción del DNA
QI Aamp MinElute Virus Spin
kit (Qiagen, Hilden, Germany)
Nanodrops 2000
(ThermoFisherScientific, USA).
Primers: Bacterias: 16S rRNA
Fungal: 28SrRNA

15. Escuela de Optometría
Fuente: http://www.scielo.br/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S1517-83822004000200006
http://iovs.arvojournals.org/article.aspx?articleid=2611258

16. Date of download: 9/5/2017 The Association for Research in Vision and Ophthalmology Copyright © 2017. All rights reserved.
From: Establishment of Multiplex Solid-Phase Strip PCR Test for Detection of 24 Ocular Infectious Disease Pathogens
Invest. Ophthalmol. Vis. Sci.. 2017;58(3):1553-1559. doi:10.1167/iovs.16-20556
Muestras positivas para (A) bacterial 16S rRNA (5/10 samples, 39.77 ± 0.51 cycles) and (B) fungal
28S rRNA (3/10 samples, 40.55 ± 0.96 cycles) present in the PCR amplification reagents, as well as
for (C) P. acnes (5/10 samples, 37.10 ± 1.52 cycles), a resident microorganism in ocular fluids and
tissues. The cut-off of Cq values (a dotted line in the graph) was set to avoid false-positive results as
follows: 35.00 for bacterial 16S and fungal 28S rRNA, and 33.00 for P. acnes.

18. Comparación: Strip PCR, qPCR (Cuantitativa) , y PCR Capilar
Sensibilidad: strip PCR con PCR capilar y qPCR.
Strip PCR detectó HSV1, HSV2, VZV, EBV, CMV, HHV6 ,
HHV7, HTLV-1, adenovirus,bacterial 16S rRNA , Candida sp. C.
glabrata, Aspergillus, 28S rRNA fúngico, T. gondii, C.
trachomatis, and Acanthamoeba.
Strip PCR, y qPCR, fueron más sensibles que la PCR capilar.
Nuevos patógenos detectados con strip PCR: adenovirus, P.
acnes, Candida sp., C. glabrata, Aspergillus, Fusarium, C.
trachomatis, and Acanthamoeba.
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19. Escuela de Optometría

20. Escuela de Optometría