Este documento describe los requerimientos nutricionales y medios de cultivo para leptospiras, incluyendo vitaminas, sales minerales, proteínas y carbohidratos esenciales. Explica los procedimientos para el aislamiento y cultivo de muestras clínicas como sangre, orina y tejido, así como factores que afectan la viabilidad. También resume el proceso de inmunización de conejos para producir antisueros contra leptospiras.

1. Cultivo de leptospiras
Tipo I
Dra. Elthy Galarza

2. Medios de cultivos
• Medio Líquido
– aislamiento
– preparación de antígeno
• Medio Semi-sólido (0.1 - 0.5% agar)
– aislamiento
– conservación
• Medio sólido (0.8 - 1.3 % agar)
– aislamiento de muestras o cultivos contaminados

3. Requerimientos nutricionales para el
crecimiento
Esenciales:
–vit B1
–vit B12
–ácido grasos de cadena larga (C15)
–fosfatos
–Ca 2+
Mg 2+
Fe 2+

4. • peptonas
• asparagina
• extracto de carne
• tween
• piruvato de sodio
• glicerol
proteínas
remplace peptonas
componente esencial
energía y carbón
facilita la multiplicación
carbono, incrementa el crecimiento
Requerimientos nutricionales para el
crecimiento. Cont....

5. • Sales:
– estabiliza la membrana
– incrementa el crecimiento
• Na+
K+
– potasio permite tiempos de generación mas
cortos que el sodio
Requerimientos nutricionales para el
crecimiento. Cont....

6. • Ca 2+,
Mg 2+
– Estabilizadores de membrana
– Células virulentas responde a altas concentraciones
de Mg
• Fe 2+
– Previene la acumulación de peróxidos orgánicos
– Sustituye Hb
• Amonio
– Fuente de nitrógeno
Requerimientos nutricionales para el
crecimiento. Cont....

7. • Suero de conejo
– Inicia el crecimiento y la velocidad
– componentes esencial
• 5 Fluoro-uracilo
– Derivado de la pirimidina, letal para varios
microorganismos, pero no para las
leptospiras
Requerimientos nutricionales para el
crecimiento. Cont....

8. Medios de cultivos
• Medio tradicional: 8-10% suero de conejo
– Stuart, Korthof, Fletcher, Vervoort, Schüffner
• Medio Tween 80/BSA de Ellinghausen y McCullough,
modificado por Johnson and Harris: EMJH
• Medio bajo o libre de proteina
– Shenberg, Bey and Johnson
• Medio enriquecido:
– Suero (fetal bovino o conejo), Hydrolysado
Lactoalbumina, Superoxide dismutase, Pyruvato
• Medio selectivo:
– 5-fluorouracil (0.01-0.04%), Neomycin, nalidixic acid,
actidione, sulfadiazol, rifampicin, amphotericin B

9. Crecimiento de leptospiras
• Medio
líquido, semi sólido, sólido
• Tiempo de duplicación
6-8 horas, algunas veces 14-18 horas
• Temperatura óptima
28-30°C

10. Cultivos
• Usualmente desde y para medio líquido usando
pipetas : Ej 0.5 mL de cultivo es tomado con una pipeta
estéril y transferido asépticamente para un tubo con 5
mL de medio.
• Visualmente no hay diferencia entre cepas, por
tanto hay que tomar mucho cuidado no mezclar,
rotulando bien los subcultivos.
• Todas las cepas deben ser monitoreadas
periódicamente por serología y autenticidad
genética.

11. Aislamiento y cultivo de muestras
clínicas de humanos
- Fase de Leptospiremia
• 1era
semana.
Sangre
- Fase de Leptospiruria y Fase Inmune.
• 2da
hasta 4ta
semana.
Líquido cefalorraquídeo y Orina

12. Cultivo de Sangre y LCR
• Inocular 2-3 gotas de sangre (EDTA, heparina) o LCR
dentro de ±5 ml de medio (suero también es posible)
• Incubar por 4-6 meses a 30 °C
• Medios (preferiblemente 5)
– EMJH
– EMJH+5-FU
– Fletcher
– EMJH+1%suero conejo+1%suero fetal bovino
– EMJH+1%suero conejo+1%suero fetal bovino+5-FU

13. Cultivo de orina
• Cultivar orina, con un tiempo no mayor de 2 horas después
de obtenida
• Inocular 1:10, 1:100 y 1:1000 en 5 mL de medio
• Incubar por 4-6 meses a 30 °C
• Medio: usar 6 tubos
– 3x EMJH+5-FU
– 3x EMJH+1%suero conejo+1%suero fetal bovino+5-FU

14. Cultivo de tejido
• Cultivar tan pronto sea posible, o mantener a 5 °C
• Triturar un pedacito de tejido (0.5 x 0.5 mm) con 1 mL de
medio o PBS pH 7.2 estéril
• Inocular 1:10, 1:100 y 1:1000 en 5 mL de medio
• Incubar por 4-6 meses a 30 °C
• Medio: usar 6 tubos
– 3x EMJH+5-FU
– 3x EMJH+1%suero conejo+1%suero fetal bovino+5-FU

15. Factores que afectan la viabilidad de
las leptospiras
• Cristalería no adecuadamente limpia
• Medios inapropiados
• Sustancias inhibidoras
• Tratamiento con antibióticos
• Contaminación
• Temperaturas de incubación (28-30 °C)
• pH del medio (7.2 - 7.4)

16. Purificación de cultivos contaminados
• Filtración (0.45 - 0.2 µm)
• 5-fluoro-uracilo, Ej. 200 µg/ml
• Plaquear en medio sólido
• Migrar a través de un filtro de 0.2 µm sobre medio sólido
• Diluciones en medio líquido selectivos
• Pase por animales (hámster, curieles)

18. INMUNIZACIÓN
• Conejo adulto, 2.5 - 5 kg
• Extracción de sangre y obtención de suero
• Realizar a los sueros Prueba de MAT , para confirmar
ausencia de Ac antileptospirales
• Al menos 2 conejos por cada cepa, y el suero será unido.
• Cultivo de cepas y aislamiento de una colonia, a partir de
medio sólido.

19. Esquema de inmunización
• Preparar un cultivo de 5-7 días con 2 x 108
leptospiras/mL
• Inocular 1, 2, 4, 6 y 6 mL del cultivo vivo en la vena marginal
de la oreja, una vez por semanas
• Analizar muestra de sangre 2 semanas despues de la ultima
inyección.
• Si el título es 1:10 000 – 1:50 000 el conejo es desangrado por
punción cardiaca o desangrado.
• Si el título es <1:10 000 entonces de nuevo inyectar 6 mL de
cultivo vivo, y analizar la sangre pasadas 2 semanas.
• Si el título se mantiene bajo, entonces inmunizar otro conejo.