Este documento describe varias pruebas bioquímicas utilizadas para identificar bacterias. Las pruebas incluyen catalasa, oxidasa, coagulasa, PYR, y medios de cultivo diferenciales que detectan la fermentación de azúcares y la producción de enzimas. Estas pruebas permiten diferenciar bacterias basadas en la presencia o ausencia de enzimas específicas.

1. Marlene Rubí Pérez Martinez
Pruebas bioquímicas

2. Las pruebas bioquímicas consisten en distintos test
químicos aplicados a medios biológicos en los cuales es
conocida su reacción, nos permiten identificar distintos
microorganismos presentes.

3. Su sistema de funcionamiento generalmente consiste
en determinar la actividad de una vía metabólica a
partir de un sustrato que se incorpora en un medio de
cultivo y que la bacteria al crecer incorpora o no

4. Se emplean para identificar de forma clara y precisa, la
presencia o ausencia de una enzima, de un grupo de
enzimas, o de una vía metabólica completa en uno o más
microorganismos. Son empleadas principalmente la
identificación y clasificación de bacterias y hongos

5. Pueden ser…
• Pruebas de identificación
rápidas
• Medio de cultivo diferencial

6. Pruebas de identificación rápidas
Pruebas de la Catalasa
Pruebas de la Oxidasa
Pruebas de la Coagulasa
Pruebas de PYR

8. ¿Qué es la catalasa?
La catalasa es una enzima que descompone el
peróxido de Hidrogeno (H2O2) en agua y oxigeno.

9. ¿Quiénes tienen catalasa? y ¿Por qué?
El peróxido de Hidrogeno se forma como uno de los
productos finales del metabolismo aerobio de los
hidratos de carbono. Si se permite que se acumule
resulta letal para la célula bacteriana.
Metabolismo
aerobio
bacteria
Catalasa

10. Fundamento de la prueba
La catalasa es una hemoproteína, cuyo grupo
prostético está formado por 4 átomos de hierro
trivalente por molécula. Esta prueba sirve para
comprobar la presencia de la enzima catalasa en
preparaciones de microorganismos. Permite
diferenciar géneros:
• Streptococcus (-) de Micrococcus (+) y/o Staphylococcus (+)
• Bacillus (+) de Clostridium (-) y Corynebacterium (+) de
Erysipelothrix (-)

11. ¿Para que nos sirve esta prueba?
Se usa con mucha frecuencia para diferenciar
miembros de la familia Micrococaceae de miembros de
la familia Streptococcaceae.
micrococcaceae
• Micrococcus
• Staphylococcus
• Planococcus
Streptococcaceae
• Streptococcus
• Pediococcus
• Aerococcus
• Planococcus
CATALASA +
CATALASA -

12. ¿Qué se necesita para realizar esta
prueba?
Peróxido de Hidrogeno al 3%
almacenado en frasco ámbar
en frío
.
Cultivo de 18-24 horas del
microorganismo a probar

13. ¿Cómo se realiza esta prueba?
Con un asa o palillo de madera,
transferir parte del centro de una
colonia a la superficie de un
portaobjetos*
Agregar 1 gota de Peróxido de
Hidrógeno al 3% y observar la
producción de burbujas

14. ¿Cuáles son los resultados esperados?
La producción rápida y sostenida de burbujas o
efervescencia constituye una reacción positiva.
Importante : Los eritrocitos poseen catalasa, por lo cual se debe
evitar tomar colonias de agar sangre para evitar falsos positivos.

16. ¿Qué es la oxidasa?
Son un grupo de enzimas que pertenecen a la categoría de
las oxido-reductasas, llevan a cabo reacciones redox,
utilizan al oxigeno como el aceptador de electrones, este es
reducido a H2O o H2O2. Su función es conservar energía
generando un gradiente de protones para producir ATP

17. Existen muchos tipos de oxidasa tales
como:
Glucosaoxidasa
Monoamina
oxidasa
NADPH oxidasa
Citocromo oxidasa

18. ¿Quiénes tienen citocromo?
Y ¿Por qué?
El sistema citocromo se encuentra en los organismos
aerobios o anaerobios facultativos, de modo que la
prueba de Oxidasa es importante para identificar
aquellos organismos que carecen de esta enzima
(anaerobios obligados).

19. Fundamento de la prueba
La reacción de la oxidasa se debe a la presencia
de un sistema citocromooxidasa que activa la
oxidación del citocromo que es reducido por el
oxigeno molecular que produce agua o peróxido
de hidrogeno según la especie bacteriana. El
oxigeno actúa por lo tanto como aceptor final en
la cadena de electrones

20. ¿Y para que nos sirve esta prueba?
Es muy útil para diferenciar
Pseudomona o
Neisserias
Enterobacterias

21. ¿Qué se necesita para realizar esta
prueba?
El reactivo de oxidasa es bastante tóxico, manejar con precaución.
Se altera por la luz y el oxígeno, por lo que debe ser de preparación
extemporánea y protegerse envolviéndolo con papel negro
Papel de filtro
cortado
(trozos de 3x 1
cm)
Placas de Petri
nuevas
Cultivo de 18-24 horas
del microorganismo a
probar
Reactivo de
oxidasa
*dimetil-fenil-diamina
*tetrametil-parafenil-
endiamina
*Tirillas de Oxidasa

22. ¿Cómo se realiza esta prueba?
Poner un trozo de
papel de filtro sobre
una de las tapaderas
de una placa de Petri.
Añadir una gota del
reactivo de oxidasa
Depositar sobre el
reactivo masa
bacteriana

23. ¿Cuáles son los resultados esperados?
La reacción positiva la indica un color azul-
violeta intenso antes de 10 segundos

25. ¿Qué es la coagulasa?
Es una enzima producida por S. aures, permite la
conversión del fibrinógeno en fibrina. Es relativamente
estable al calor, resiste temperaturas arriba de 60C por
30 minutos.

26. ¿Quiénes tienen coagulasa? Y ¿Por
qué?
Los Staphylococcus aureus, representa un importante
factor de virulencia. La coagulasa puede unirse al
fibrinógeno y convertirlo en fibrina insoluble, la cual
tiende a formar depósitos donde pueden agregarse

27. Fundamento de la prueba
La coagulasa es un enzima capaz de
desnaturalizar la fibrina del plasma. El objetivo
es buscar un factor de aglutinación de los
microorganismos cuando estos se mezclan con
plasma. Esta prueba se utiliza para diferenciar
microorganismos del género Staphylococcus.

28. ¿Para que sirve esta prueba?
La prueba de la coagulasa es usada específicamente
para diferenciar las especies del genero
staphylococccus
Nota: también es producida por Yersinia pestis.

29. ¿Qué se necesita para realizar esta
prueba?
plasma de conejo
Cultivo de 18-24
horas del
microorganismo a
probar

30. ¿Cómo se realiza esta prueba?
En un tubo pequeño Mezcle
un asa cargada con el
microorganismo Con 0,5 mL
de plasma de conejo
Incube en baño de agua a
37°C y examine
periódicamente.

31. ¿Cuáles son los resultados esperados?
Los Staphylococcus aureus siempre da positivo, las
demás especies no.
Para obviar esta posible fuente de error, se recomienda utilizar
plasma en el cual se ha utilizado EDTA como anticoagulante

33. ¿En qué consiste?
Detecta la enzima pirrolidonil arilamidasa se
utiliza como sustrato el reactivo L-pirrolidonil-
beta-naftilamida (PYR), para la identificación
rápida de enterococos

34. Solución fisiológica en tubo
Disco de PYR
¿Qué se necesita para realizar esta
prueba?
Cultivo de 18-24 horas del
microorganismo a probar

35. ¿Cómo se realiza esta prueba?
Realizar un alto
inóculo en solución
fisiológica
Introducir un disco de
PYR.
incubar 30 minutos a
35º

36. ¿Cuáles son los resultados esperados?
Consideraciones: Algunas especies de Staphylococcus y
los estreptococos del grupo A dan, también, una
prueba positiva

37. Pueden ser…
• Pruebas de identificación
rápidas
• Medio de cultivo diferencial

38. Medio de cultivo diferencial

39. • Color rojo ladrillo
• Inhibidores: no tiene
• Indicador: rojo de fenol
• Sustratos principales: lactosa, sacarosa y glucosa
(la proporción en el medio de lactosa y sacarosa es de
10: 1 con la glucosa)
• Sustratos secundarios: tiosulfato sódico, peptona,
citrato férrico amoniacal y extractos.
Se siembra por picadura profunda con aguja y luego se siembra por
estrías en el pico

40. Resultados
• Fuente de carbono utilizada
(produce un viraje del rojo al amarillo)
– Lactosa ocurre en la parte superior
– sacarosa en la parte intermedia
– glucosa en la parte profunda
• El tiosulfato es reducido a H2S quien reacciona con el
citrato férrico amoniacal para dar formación al sulfuro
de fierro que es de color negro.
• La presencia de gas se debe al CO2 producto de la
fermentación.

41. En este medio se busca determinar la capacidad de la bacteria para
degradar los azúcares, la formación de gas y de H2S.
Tubo Control 1 2 3 4 5
Fermentan glucosa - - + + - -
Fermentan sacarosa - - - - - -
Fermentan lactosa - - - - + -
Formación de H2S - - - - + +
gas - - - + - -

42. • Color: lila
• Inhibidores: no tiene
• Indicador: púrpura de bromocresol
• Sustratos principales: lisina y glucosa
• Sustratos secundarios: peptona, tiosulfato
de sodio, extracto de levaduras.
Se siembra por picadura profunda con aguja y luego por estrías en
el pico

43. Resultados
• Descarboxilación de lisina en la diamina cadaverina y
desaminación de la lisina en un alfa cetoácido.
(viraje del indicador púrpura de bromocresol)
• La formación de H2S se pone de manifiesto por la
presencia del tiosulfato sódico, que dará
formación al sulfato férrico.
• También puede verificarse la formación de gas a
partir de la degradación de la glucosa.

44. En este medio se permite evidenciar la descarboxilación del
aminoácido lisina en la diamina cadaverina, como también la
desaminación de la lisina en un alfa cetoácido
Tubo Control 1 2 3
Lisina descarboxilasa - + + -
H2S - - - +
Formación de gas - - + +

45. • Color: lila
• Inhibidor: no tiene
• Indicador: púrpura de bromocresol
• Sustratos principales: ornitina y glucosa.
• Sustratos secundarios: peptona, triptona y
extractos.
Se siembra por picadura profunda

46. Resultados
• La ornitina es descarboxilada por la enzima ornitina
descraboxilasa para producir la diamina putrescina y
CO2
– Positivo purpura
– Negativo amarillo
• La motilidad
– Positiva se demuestra por un (enturbamiento del medio)
– Negativa (crecen a lo largo de la línea de inoculación)
• La prueba del indol se basa en la reacción que se
produce con el rvo de Kovacs.
(produce un color rojo)

47. Este medio se usa para la identificación de enterobacterias en
base a su movilidad, producción de indol y actividad de
ornitina descarboxilasa.
Tubo control 1 2 3 4 5 6
La ornitina + - - + + + +
La motilidad - + + - - - -
La prueba del indol - - + - - - +

48. • Color: crema
• Inhibidores: no tiene
• Indicador: no tiene
• Sustrato principal: peptona
• Sustrato secundario: tiosulfato sódico, hierro
y amonio
Este medio se utiliza para comprobar la motilidad, la formación de H2S y
la producción de indol por parte de la bacteria. Se siembra por picadura

49. Resultados
• La motilidad
– Positiva (turbidez difusa)
– Negativa (crecimiento a lo largo de la línea de
inoculación)
• La producción de H2S
(ennegrecimiento de la zona de crecimiento o del medio)
• La prueba del indol se basa en la reacción que se
produce con el rvo de Kovacs.
(produce un color rojo)

50. Tubo Control 1 2 3 4 5
motilidad - + - - + +
H2S - - - + - +
Indol - + - - - +

51. • Color: rojo
• Inhibidor: no tiene
• Indicador: rojo de fenol
• Sustratos principales: lactosa y glucosa
• Sustratos secundarios: peptona, extractos
y tiosulfato sódico.
Se siembra por picadura profunda con aguja y luego se siembra por
estrías en el pico

52. Resultados
• Fuente de carbono
• La formación de H2S se demostrará por el
ennegrecimiento del medio.

53. Este medio se emplea para la identificación de bacilos gram –
basada en la fermentación de la lactosa y la glucosa y en la
producción de H2S.
tubo control 1 2 3 4
Fermenta glucosa - - - + +
Fermenta lactosa - + + - -
Formación de H2S - - - - +

54. • Color: verde
• Inhibidor: no tiene
• Indicador: azul de bromotimol
• Sustrato principal: citrato de sodio
• Sustratos secundarios: fosfato dipotásico,
cloruro de sodio, sulfato de magnesio y
fosfato monoamónico.
Se siembra por picadura profunda con aguja y luego por estrías en el
pico.

55. Resultados
• La degradación del citrato con lleva a la
alcalinización del medio
– Positivo (azul)
– Negativo (verde)

56. Este medio nos permite comprobar la capacidad de la
bacteria de utilizar el citrato como fuente exclusiva de
carbono

57. • Color: rosado
• Inhibidor: no tiene
• Indicador: rojo de fenol
• Sustrato principal: úrea
• Sustrato secundario: extracto de levaduras, fosfato
monopotásico y fosfato disódico.
Este medio no se autoclava

58. Resultados
• La degradación de urea por medio de ureasa a
amoniaco y carbonato de amonio, alcalinizan
el medio
(el rojo de fenol vira a un rojo cereza)
– Bacterias úrea + (rosa mexicano o rojo cereza)
– Bacterias úrea - (Amarillo)

59. En este medio se observa la capacidad de la bacteria de degradar
la urea por medio de la enzima ureasa formando amoniaco y
carbonato de amonio.

60. Bibliografía
1. Jean F. MacFaddin, 2003 Pruebas bioquímicas para la identificación de
bacterias de importancia clínica 3ª Edición, Ed. Medica panamericana,
Buenos Aires Argentina
2. http://depa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/U3c_PruebasBioquimicas_
17461.PDF
3. Whinn H., Allen, Janda, Koneman, Procop, Schreckenberger. 2008
Microbiological diagnosis,6ª Edición, Ed. Medica panamericana, Buenos
Aires, Argentina
4. https://www.studyblue.com/notes/note/n/microbio-practicum-review-
5-catabolism/deck/11103074
5. Álvaro Gonzales Hernández, 2014, Principios de bioquímica clínica y
patología molecular , 2ª Edición, ELSEVIER, México
6. Imágenes de: http://microbeonline.com
7. Geo. F. Brooks, Karen C. Carroll, Janet S. Butel, Stephen A. Morse,
Timothy A. Mienzaner., 2014 Microbiologia medica, 26ª Edición,
McGraw-Hill, Mexico