1) El documento introduce la técnica de PCR-ITS para la caracterización molecular de organismos fúngicos mediante la amplificación de las regiones ITS1 e ITS2 de los genes ribosomales rRNA, lo que permite la identificación de especies fúngicas. 2) Explica detalladamente los pasos para realizar esta técnica, incluyendo la extracción de ADN, PCR, secuenciación, análisis de secuencias y análisis filogenéticos. 3) También proporciona ejemplos y referencias de bases de datos mole
En esta presentación se exponen las técnicas aplicadas para el aislamiento, purificación y cuantificación de ácidos nucleicos previos a su utilización para la aplicación de técnicas de diagnóstico molecular. Se exponen también los fundamentos y las principales caracteristicas de cada técnica.
En esta presentación se exponen las técnicas aplicadas para el aislamiento, purificación y cuantificación de ácidos nucleicos previos a su utilización para la aplicación de técnicas de diagnóstico molecular. Se exponen también los fundamentos y las principales caracteristicas de cada técnica.
ADN es la abreviatura del ácido desoxirribonucleico (en inglés, DNA). Constituye el material genético de los organismos. Es el componente químico primario de los cromosomas y el material del que los genes están formados.
métodos diagnóstico virológicos
western blot
dot blot
northern blot
southern blot
hibridación de ácidos nucleicos
PCR
obtención de muestra
líquido cefalorraquídeo
ANF
lesiones cutáneas
sangre: suero
virología
Curso de Biotecnología Animal para estudiantes de la Carrera de Ingenieros Agrónomos Zootecnistas. Facultad de Ciencias Agropecuarias - Universidad de Panamá
Métodos y estrategias de secuenciamiento de alto rendimiento. AplicacionesBiocientificaSA
Presentación: "Métodos y estrategias de secuenciamiento de alto rendimiento. Aplicaciones" en el Curso Básico y Taller de PCR en Tiempo Real. HIGA Rossi La Plata, 22 y 23 de Noviembre, 2012. Organiza: Laboratorio de Virología y Biología Molecular H.I.G.A. R. Rossi - La Plata. Auspicia: Servicio de Docencia e Investigación - HIGA Rossi La Plata y Comunidad Vita - Biocientífica S.A.
Expresión in vitro de las interleucinas 2 y 10 de linfocitos de alpacas antíg...Raquel Watanabe
El objetivo del presente estudio fue determinar, mediante la técnica de RT-PCR Tiempo
Real y cuantificación relativa según el método 2-Ct, los niveles relativos de expresión
in vitro de ARN mensajero de IL-2 e IL-10 en leucocitos circulantes de alpacas en
presencia de antígenos clostridiales, empleándose como control endógeno a GAPDH. Se
colectó sangre entera de 10 alpacas adultas. Las muestras fueron centrifugadas para
obtener la fracción leucocitaria en gradiente de Ficoll, colectándose la capa flogística. Se
hizo un pool de leucocitos que fueron purificados con cloruro de amonio. Se centrifugó
y la concentración se ajustó a 500 000 células vivas/ml de medio mínimo esencial (MEM).
Fueron cultivados en placas para cultivo celular de 24 pocillos y enfrentados a suspensiones
de extracto clostridial a las concentraciones de 400, 16, 0.8 y 0.2 μg/ml por 1, 12 y
24 h. Posteriormente, se realizó la RT-qPCR. La cinética de la expresión de IL-2 mostró una
tendencia no significativa inversamente proporcional a la dosis de antígeno clostridial en
los tres tiempos de incubación, a diferencia de IL-10 cuya expresión fue variable, alcanzando
el máximo a las 12 h de incubación (p<0.05) y mostrando un patrón similar al de IL-
2 en la dosis de 16 μg/ml de antígeno clostridial. La expresión de IL-10 superó hasta en 40
veces lo expresado por el calibrador respecto a IL-2, evidenciándose una marcada respuesta
hacia la polarización del subtipo Th2.
ADN es la abreviatura del ácido desoxirribonucleico (en inglés, DNA). Constituye el material genético de los organismos. Es el componente químico primario de los cromosomas y el material del que los genes están formados.
métodos diagnóstico virológicos
western blot
dot blot
northern blot
southern blot
hibridación de ácidos nucleicos
PCR
obtención de muestra
líquido cefalorraquídeo
ANF
lesiones cutáneas
sangre: suero
virología
Curso de Biotecnología Animal para estudiantes de la Carrera de Ingenieros Agrónomos Zootecnistas. Facultad de Ciencias Agropecuarias - Universidad de Panamá
Métodos y estrategias de secuenciamiento de alto rendimiento. AplicacionesBiocientificaSA
Presentación: "Métodos y estrategias de secuenciamiento de alto rendimiento. Aplicaciones" en el Curso Básico y Taller de PCR en Tiempo Real. HIGA Rossi La Plata, 22 y 23 de Noviembre, 2012. Organiza: Laboratorio de Virología y Biología Molecular H.I.G.A. R. Rossi - La Plata. Auspicia: Servicio de Docencia e Investigación - HIGA Rossi La Plata y Comunidad Vita - Biocientífica S.A.
Expresión in vitro de las interleucinas 2 y 10 de linfocitos de alpacas antíg...Raquel Watanabe
El objetivo del presente estudio fue determinar, mediante la técnica de RT-PCR Tiempo
Real y cuantificación relativa según el método 2-Ct, los niveles relativos de expresión
in vitro de ARN mensajero de IL-2 e IL-10 en leucocitos circulantes de alpacas en
presencia de antígenos clostridiales, empleándose como control endógeno a GAPDH. Se
colectó sangre entera de 10 alpacas adultas. Las muestras fueron centrifugadas para
obtener la fracción leucocitaria en gradiente de Ficoll, colectándose la capa flogística. Se
hizo un pool de leucocitos que fueron purificados con cloruro de amonio. Se centrifugó
y la concentración se ajustó a 500 000 células vivas/ml de medio mínimo esencial (MEM).
Fueron cultivados en placas para cultivo celular de 24 pocillos y enfrentados a suspensiones
de extracto clostridial a las concentraciones de 400, 16, 0.8 y 0.2 μg/ml por 1, 12 y
24 h. Posteriormente, se realizó la RT-qPCR. La cinética de la expresión de IL-2 mostró una
tendencia no significativa inversamente proporcional a la dosis de antígeno clostridial en
los tres tiempos de incubación, a diferencia de IL-10 cuya expresión fue variable, alcanzando
el máximo a las 12 h de incubación (p<0.05) y mostrando un patrón similar al de IL-
2 en la dosis de 16 μg/ml de antígeno clostridial. La expresión de IL-10 superó hasta en 40
veces lo expresado por el calibrador respecto a IL-2, evidenciándose una marcada respuesta
hacia la polarización del subtipo Th2.
El diagnóstico molecular está basado en el análisis de los ácidos nucleicos ADN y ARN. El análisis de ADN permite obtener información de la estructura de un gen, mientras que el análisis del ARN aporta la información funcional sobre la expresión de una proteína. En la presente actividad de laboratorio se realizó la extracción de ADN de cepas de Trichoderma longibrachiarum (LIG052), Trichoderma atroviride (LIG042), Botrytis sp. (LIG035) y Stromatinia cepivorum (LIG020), y para ARN se empleó una cepa de Trichoderma harzianum (LIG064). La extracción de ADN se practicó utilizando el protocolo modificado para extracción de ADN de Crinipellis, y para ARN el protocolo de extracción de ARN de fruto de fresa, ambos propuestos por el Laboratorio de Investigaciones Genéticas UNET. Se verifico la calidad de las muestras mediante electroforesis en gel de agarosa 1%, observándose un recorrido difuso de las bandas electroforéticas debido a fallas reveladas durante el proceso.
El uso de agentes de control biológico antagonistas del suelo, tales como Trichoderma sp., es reconocido ampliamente como un método de lucha contra enfermedades causadas por hongos del suelo. Diversas cepas han sido evaluadas, determinando su efecto inductor de mecanismos de defensa local y sistémico, por medio de interacciones entre el antagonista con las raíces, conduciendo a la acumulación de moléculas de defensa, como las peroxidasas. Al efecto, para evaluar la presencia de diferentes compuestos inductores de la resistencia a diversas enfermedades se realizó la presente actividad de laboratorio, evaluando las cepas de Trichoderma sp. LIG064 y LIG006. El material para la extracción de proteínas e isoenzimas, y la separación mediante electroforesis en geles de poliacrilamida SDS-PAGE, se realizó siguiendo el protocolo modificado citado por Salazar et al. (2011). En general, la lectura de las bandas permitió diferenciar la presencia de elementos inductores de control biológico en las cepas de Trichoderma sp. evaluadas.
PRÁCTICA Nº 4: “Análisis de secuencias del ADN con el software BioEdit y uso ...dramosbrise1403
Es muy importante aprender a usar el programa BioEdit, ya que, nos ayuda a poder identificar el alineamiento de las secuencias y también nos permite editar alineamientos múltiples.
SIMULACIÓN MOLECULAR DE ADN USANDO EL SOFTWARE SNAPGENE-CUELA CAMACHO AGUSTÍN...AgustnJuniorCuelaCam
SIMULACION DE ELECTROFOROSIS EN GEL AGAROSA UTILIZANDO EL PROGRAMA SNAP GENE CON DATOS DEL ARTICULO CIENTIFICO “Aislamiento de bacterias con potencial biorremediador y análisis de comunidades bacterianas de zona impactada por derrame de petróleo en Condorcanqui – Amazonas - Perú”
1. MODULO 2.2. INTRODUCCION A LA BIOLOGIA DE ORGANISMOS FUNGOSOS
Dra. María de Jesús Yáñez Morales: Tutor
Noviembre, 2013
CAPITULO VI.
yanezmj@colpos.mx. Ofna. 118, Lab. 128
CP-Montecilllo: 595-95-20200, ext. 1663
Caracterización molecular de organismos
fungosos por PCR-ITS de genes ribosomales
rDNA o rRNA. *CONOCIMIENTO BASICO*
y
DNA BARCODE OF LIFE ¡!!!!
http://www.barcoding.si.edu/
y,
CHARLES DARWIN ????
Introducción
Actualmente las técnicas moleculares, paralelamente con la identificació n
morfológica, son complementarias en la identificación de especies. Entre especies
fungosas con morfología difícil de diferenciar, la técnica molecular con uso de “primers
específicos” es la única confiable. Las técnicas moleculares en Laboratorios de
Diagnóstico Acreditados, se usan de rutina, y además, en casos de urgencia del
diagnóstico, permiten una rápida identificación por PCR en Tiempo Real de los
organismos en tejidos vegetales, semillas, etc., sin requerir del aislamiento del
organismo en cult ivo. Otro uso de las técnicas es en análisis filogenéticos.
La técnica más comúnmente usada es ITS (Internal Transcribed Spacer) de las
regiones ITS1 e ITS2, por PCR (Polymerase Chain Reaction), y con uso de primers
universales que amplifican los genes nucleares rRNA: 18S-5.8S-28S, más sus regiones
internas ITS (ver mapa). Estos genes son de altamente conservados (18S) a un poco
menos conservados (28S), y sus regiones internas ITS tienen variabilidad (mayor
cuando las diferencias morfológicas son evidentes, menor cuando tales diferencias son
tenues, o nula en especies similares morfológicamente), en la secuencia de sus
nucleótidos que permite diferenciar especies y detectar mutaciones.
1
2. VER DIAPOSITIVAS
VI.2. Pasos globales a seguir para realizar técnica:
1. Producción del micelio por cultivo monospórico
2. Extracción del ADN problema
3. Electroforesis
4. PCR
5. Electroforesis
6. Purificación
7. Secuenciación. MACROGEN: http://www.macrogenusa.com
8. Análisis de la secuencia: programa DNASTAR (altamente recomendado,
requiere licencia)
9. Alineamiento de la secuencia en el banco de genes NCBI (National Center for
Biotechnology Information) (acceso libre en internet)
10. Depósito de las secuencias en NCBI (genera un número de registro o acceso)
11. Análisis filogenéticos (con Bootstrap, 5000 repeticiones) por MEGA.10
(libre en internet) o DNASTAR (requiere licencia), etc., etc.
12. Deposito de Arboles Filogenéticos en: TreeBASE
http://www.treebase.org/treebaseweb/home.html;jsessionid=2A8BA90B7B56713AFB9434DAAD582B69
TRABAJO DE LABORATORIO
A. Extracción de DNA y RNA por el kit: reactivo Plant RNA Purification Reagent
(Invitogen® No. Cat. 12322-012). Especial para extraer ADN de esporas tomadas
directo de los síntomas.
Existen múltiples kits de técnicas opcionales para extracción del DNA y también
de formulación en el propio laboratorio como la técnica de Ahrens and
Seemüller (1992), CTAB (Bromuro de Cetiltrimetilamonio), etc.
2
3. 1. Colocar el micelio en un mortero previamente estéril y congelado (también se
puede usar nitrógeno liquido), triturar la muestra hasta dejarla en una
consistencia de polvo.
2. Depositar todo el polvo a un tubo de microcentrifuga estéril de 1.5 mL, con
500μL Plant RNA Purification Reagent, agitar en vortex por 30 seg. hasta que el
macerado este totalmente resuspendido.
3. Incubar por 5 min a temperatura ambiente (poner el tubo horizontalmente para
maximizar el área durante la extracción).
4. Clarificar la solución, por centrifugación a 12 000g por 2 min. Transferir el
sobrenadante a otro tubo estéril, ponerlo en hielo.
5. Adicionar100μL de NaCl 5M para clarificar el extracto y mezclar por inversión.
6. Adicionar 300 μL de cloroformo. Mezclar por inversión.
7. Centrifuga por 10 minutos a 12000g y transfiere cuidadosamente el
sobrenadante a un tubo de 1.5 mL limpio y estéril.
8. Precipitar el DNA del sobrenadante con un volumen igual de isopropanol, y
mezcla por inversión e incuba al menos por 10 minutos sobre hielo.
9. Centrifugar a 4oC por 10 minutos a 12 000g,
10. Decanta el sobrenadante, teniendo cuidado de no perder el pellet (pastilla). Lava
la pastilla con 1 mL de etanol al 70% y centrifuga a 12 000g por 5 minutos,
escurre los excesos de la pastilla sobre papel absorbente y espera a que seque
11. Resuspende la pastilla en 50μL de agua estéril libre de nucleasas y procede a la
verificación de la integridad, calidad y cantidad del DNA y el RNA.
B. ELECTROFORESIS.
La electroforesis en gel de agarosa o acrilamida es el método estándar utilizado para
separar, identificar y purificar fragmentos de ADN (Sambrook et al., 1989).
La
preparación del gel está basada en el volumen total del molde del gel (30, 50 o 100, 200
mL. El procedimiento es sencillo y consiste en lo siguiente:
1. Coloque en un matraz Erlenmeyer ultra pura agarosa (para un gel al 1 % p/v) y
agregue amortiguador TBE 1X.
2. Coloque el matraz en el horno de microondas por segundos hasta que inicie una
tenue ebullición y se disuelva la agarosa.
3
4. 3. Transfiera el agarosa al portagel de la cámara de electroforesis y coloque los
correspondientes peines.
4. Después de 30 minutos, con el agar solidificado, retire con cuidado los peines.
5. Agregue a la cámara 200 ml de amortiguador TBE1X (hasta que se cubran los pozos
con el amortiguador).
6. Sobre parafilm, coloque la muestra1. Agregue 2 µl de colorante azul de bromofenol
y agua destilada para llevar el volumen final a 10 µl.
7. Con la micropipeta homogeneice la muestra y transfiérala a uno de los pozos del gel
de agarosa.
8. Encienda la fuente de poder programando el voltaje constante.
9. Permita que avance la electroforesis hasta que el azul de bromofenol recorra 2/3 de
la distancia del gel.
10. Apague la fuente de poder y retire cuidadosamente el gel.
11. Coloque el gel en una solución de bromuro de etidio y manténgalo durant e 15 min.
C. PCR-ITS (White et al., 1990)
Iniciadores (primers) universales:
ITS1
ITS2
ITS3
ITS4
ITS5
TCCGTAGGTGAACCTGCGG
ver White et al., 1990
ver White et al., 1990
TCCTCCGCTTATTGATATGC
GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG
4
5. Condiciones de reacción del PCR:
Concentración
Ultrapura estéril
H2 O
Buffer
MgCl2
dNTP´s
(mezcla de A, G,
C, T)
Taq DNA
polimerase
ADN1
ITS4
ITS5
VOLUMEN
FINAL:
(25, 50, o 100 µl)
1X
1.5 mM
0.2 mM,
Volumen
µl
13.22
2.5
2.08
2.0
1U
0.2
80 ng
20 pmol
20 pmol
1.0
2.0
2.0
25.0
1
La cantidad de muestra que se agregue variara dependiendo de la concentración de ADN.
D. Programa de amplificación (termociclador):
Inicial desnaturalización 95°C durante 2’,
Desnaturalización 30 ciclos de 95°C x 1’,
Annealing 50°C x 30”,
Extensión 72° x 2’ y
Extensión final 72°C x 10´.
REGRESAR: B, electroforesis
E. Purificación del producto de PCR (por QIAquick PCR purification Kit)
Ver VI.2. (pasos 7-11)
F. Secuenciación en dos direcciones con los mismos primers usados
G. Análisis de secuencias
H. Depósito de secuencias en NCBI
I. Deposito de Arboles Filogenéticos en: TreeBASE
5
6. Ejemplo aplicado. VER ARTICULO EN BB: González-Pérez, E., Yáñez-Morales,
Ma. de J., Ortega-Escobar, H. M. & Velásquez-Mendoza, J. 2009. Comparative analysis
among pathogenic fungal species that cause gladiolus (Gladiolus grandiflorus Hort.)
corm rot in Mexico. Revista Mexicana de Fitopatología 27 (1): 45-52.
FUENTES DE TAXONOMICA INFORMACION
1. NCBI (National Center for Biotechnology Information, GenBank).
Taxonomy: http://www.ncbi.nlm.nih.gov
Nucleotide: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?db=nuccore&itool=toolbar
2. BARCODE OF LIFE DATA SYSTEMS. BOLDSYSTEMS.org
http://www.boldsystems.org./views/login.php
FUNGAL DATABASE
3. CBS. KNAW FUNGAL BIODIVERSITY CENTRE. http://www.cbs.knaw.nl/
4. MYCOBANK:
http://www.mycobank.org
→
search
5. Bibliography of Systematic Mycology
6. CyberLiber
7. Biodiversity Heritage Library
8. Index Fungorum
Etc. etc.,
OTRAS BASES:
6
7. 9. ITIS. Integrated Taxonomic Information System.
http://www.itis.gov/index.html
Welcome to ITIS, the Integrated Taxonomic Information System! Here you will find
authoritative taxonomic information on plants, animals, fungi, and microbes of North
America and the world. We are a partnership of U.S., Canadian, and Mexican agencies
(ITIS-North America); other organizations; and taxonomic specialists. ITIS is also a
partner of Species 2000 and the Global Biodiversity Information Facility (GBIF). The
ITIS and Species 2000 Catalogue of Life (CoL) partnership is proud to provide the
taxonomic backbone to the Encyclopedia of Life (EOL).
10. Google Scholar
11. BIOSIS, Biological abstracts
12. CABI
13. Agrícola
Etc., etc.
Referencias
Ahrens, U., and E. Seemüller. 1992. Detection of DNA of plant pathogenic mycoplasmalike
organisms by polimerase chain reaction that amplifies a sequence of the 16s rRNA
gene. Phytopathology 82: 828-832.
White, T.J., T. Bruns, S. Lee, and J. Taylor. 1990. Amplification and Direct Sequencing of
Fungal Ribosomal RNA Genes for Phylogenetics. In: PCR Protocols: A Guide to
Methods and Applications. MA Innis, D. H. Gelfand, J. J. Sninsky, and T. J. White
(eds). Academic Press, San Diego, CA. USA. pp: 315-322.
7