1) El documento introduce la técnica de PCR-ITS para la caracterización molecular de organismos fúngicos mediante la amplificación de las regiones ITS1 e ITS2 de los genes ribosomales rRNA, lo que permite la identificación de especies fúngicas. 2) Explica detalladamente los pasos para realizar esta técnica, incluyendo la extracción de ADN, PCR, secuenciación, análisis de secuencias y análisis filogenéticos. 3) También proporciona ejemplos y referencias de bases de datos mole

1. MODULO 2.2. INTRODUCCION A LA BIOLOGIA DE ORGANISMOS FUNGOSOS
Dra. María de Jesús Yáñez Morales: Tutor
Noviembre, 2013
CAPITULO VI.
yanezmj@colpos.mx. Ofna. 118, Lab. 128
CP-Montecilllo: 595-95-20200, ext. 1663
Caracterización molecular de organismos
fungosos por PCR-ITS de genes ribosomales
rDNA o rRNA. *CONOCIMIENTO BASICO*
y
DNA BARCODE OF LIFE ¡!!!!
http://www.barcoding.si.edu/
y,
CHARLES DARWIN ????
Introducción
Actualmente las técnicas moleculares, paralelamente con la identificació n
morfológica, son complementarias en la identificación de especies. Entre especies
fungosas con morfología difícil de diferenciar, la técnica molecular con uso de “primers
específicos” es la única confiable. Las técnicas moleculares en Laboratorios de
Diagnóstico Acreditados, se usan de rutina, y además, en casos de urgencia del
diagnóstico, permiten una rápida identificación por PCR en Tiempo Real de los
organismos en tejidos vegetales, semillas, etc., sin requerir del aislamiento del
organismo en cult ivo. Otro uso de las técnicas es en análisis filogenéticos.
La técnica más comúnmente usada es ITS (Internal Transcribed Spacer) de las
regiones ITS1 e ITS2, por PCR (Polymerase Chain Reaction), y con uso de primers
universales que amplifican los genes nucleares rRNA: 18S-5.8S-28S, más sus regiones
internas ITS (ver mapa). Estos genes son de altamente conservados (18S) a un poco
menos conservados (28S), y sus regiones internas ITS tienen variabilidad (mayor
cuando las diferencias morfológicas son evidentes, menor cuando tales diferencias son
tenues, o nula en especies similares morfológicamente), en la secuencia de sus
nucleótidos que permite diferenciar especies y detectar mutaciones.
1

2. VER DIAPOSITIVAS
VI.2. Pasos globales a seguir para realizar técnica:
1. Producción del micelio por cultivo monospórico
2. Extracción del ADN problema
3. Electroforesis
4. PCR
5. Electroforesis
6. Purificación
7. Secuenciación. MACROGEN: http://www.macrogenusa.com
8. Análisis de la secuencia: programa DNASTAR (altamente recomendado,
requiere licencia)
9. Alineamiento de la secuencia en el banco de genes NCBI (National Center for
Biotechnology Information) (acceso libre en internet)
10. Depósito de las secuencias en NCBI (genera un número de registro o acceso)
11. Análisis filogenéticos (con Bootstrap, 5000 repeticiones) por MEGA.10
(libre en internet) o DNASTAR (requiere licencia), etc., etc.
12. Deposito de Arboles Filogenéticos en: TreeBASE
http://www.treebase.org/treebaseweb/home.html;jsessionid=2A8BA90B7B56713AFB9434DAAD582B69
TRABAJO DE LABORATORIO
A. Extracción de DNA y RNA por el kit: reactivo Plant RNA Purification Reagent
(Invitogen® No. Cat. 12322-012). Especial para extraer ADN de esporas tomadas
directo de los síntomas.
Existen múltiples kits de técnicas opcionales para extracción del DNA y también
de formulación en el propio laboratorio como la técnica de Ahrens and
Seemüller (1992), CTAB (Bromuro de Cetiltrimetilamonio), etc.
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3. 1. Colocar el micelio en un mortero previamente estéril y congelado (también se
puede usar nitrógeno liquido), triturar la muestra hasta dejarla en una
consistencia de polvo.
2. Depositar todo el polvo a un tubo de microcentrifuga estéril de 1.5 mL, con
500μL Plant RNA Purification Reagent, agitar en vortex por 30 seg. hasta que el
macerado este totalmente resuspendido.
3. Incubar por 5 min a temperatura ambiente (poner el tubo horizontalmente para
maximizar el área durante la extracción).
4. Clarificar la solución, por centrifugación a 12 000g por 2 min. Transferir el
sobrenadante a otro tubo estéril, ponerlo en hielo.
5. Adicionar100μL de NaCl 5M para clarificar el extracto y mezclar por inversión.
6. Adicionar 300 μL de cloroformo. Mezclar por inversión.
7. Centrifuga por 10 minutos a 12000g y transfiere cuidadosamente el
sobrenadante a un tubo de 1.5 mL limpio y estéril.
8. Precipitar el DNA del sobrenadante con un volumen igual de isopropanol, y
mezcla por inversión e incuba al menos por 10 minutos sobre hielo.
9. Centrifugar a 4oC por 10 minutos a 12 000g,
10. Decanta el sobrenadante, teniendo cuidado de no perder el pellet (pastilla). Lava
la pastilla con 1 mL de etanol al 70% y centrifuga a 12 000g por 5 minutos,
escurre los excesos de la pastilla sobre papel absorbente y espera a que seque
11. Resuspende la pastilla en 50μL de agua estéril libre de nucleasas y procede a la
verificación de la integridad, calidad y cantidad del DNA y el RNA.
B. ELECTROFORESIS.
La electroforesis en gel de agarosa o acrilamida es el método estándar utilizado para
separar, identificar y purificar fragmentos de ADN (Sambrook et al., 1989).
La
preparación del gel está basada en el volumen total del molde del gel (30, 50 o 100, 200
mL. El procedimiento es sencillo y consiste en lo siguiente:
1. Coloque en un matraz Erlenmeyer ultra pura agarosa (para un gel al 1 % p/v) y
agregue amortiguador TBE 1X.
2. Coloque el matraz en el horno de microondas por segundos hasta que inicie una
tenue ebullición y se disuelva la agarosa.
3

4. 3. Transfiera el agarosa al portagel de la cámara de electroforesis y coloque los
correspondientes peines.
4. Después de 30 minutos, con el agar solidificado, retire con cuidado los peines.
5. Agregue a la cámara 200 ml de amortiguador TBE1X (hasta que se cubran los pozos
con el amortiguador).
6. Sobre parafilm, coloque la muestra1. Agregue 2 µl de colorante azul de bromofenol
y agua destilada para llevar el volumen final a 10 µl.
7. Con la micropipeta homogeneice la muestra y transfiérala a uno de los pozos del gel
de agarosa.
8. Encienda la fuente de poder programando el voltaje constante.
9. Permita que avance la electroforesis hasta que el azul de bromofenol recorra 2/3 de
la distancia del gel.
10. Apague la fuente de poder y retire cuidadosamente el gel.
11. Coloque el gel en una solución de bromuro de etidio y manténgalo durant e 15 min.
C. PCR-ITS (White et al., 1990)
Iniciadores (primers) universales:
ITS1
ITS2
ITS3
ITS4
ITS5
TCCGTAGGTGAACCTGCGG
ver White et al., 1990
ver White et al., 1990
TCCTCCGCTTATTGATATGC
GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG
4

5. Condiciones de reacción del PCR:
Concentración
Ultrapura estéril
H2 O
Buffer
MgCl2
dNTP´s
(mezcla de A, G,
C, T)
Taq DNA
polimerase
ADN1
ITS4
ITS5
VOLUMEN
FINAL:
(25, 50, o 100 µl)
1X
1.5 mM
0.2 mM,
Volumen
µl
13.22
2.5
2.08
2.0
1U
0.2
80 ng
20 pmol
20 pmol
1.0
2.0
2.0
25.0
1
La cantidad de muestra que se agregue variara dependiendo de la concentración de ADN.
D. Programa de amplificación (termociclador):
Inicial desnaturalización 95°C durante 2’,
Desnaturalización 30 ciclos de 95°C x 1’,
Annealing 50°C x 30”,
Extensión 72° x 2’ y
Extensión final 72°C x 10´.
REGRESAR: B, electroforesis
E. Purificación del producto de PCR (por QIAquick PCR purification Kit)
Ver VI.2. (pasos 7-11)
F. Secuenciación en dos direcciones con los mismos primers usados
G. Análisis de secuencias
H. Depósito de secuencias en NCBI
I. Deposito de Arboles Filogenéticos en: TreeBASE
5

6. Ejemplo aplicado. VER ARTICULO EN BB: González-Pérez, E., Yáñez-Morales,
Ma. de J., Ortega-Escobar, H. M. & Velásquez-Mendoza, J. 2009. Comparative analysis
among pathogenic fungal species that cause gladiolus (Gladiolus grandiflorus Hort.)
corm rot in Mexico. Revista Mexicana de Fitopatología 27 (1): 45-52.
FUENTES DE TAXONOMICA INFORMACION
1. NCBI (National Center for Biotechnology Information, GenBank).
Taxonomy: http://www.ncbi.nlm.nih.gov
Nucleotide: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?db=nuccore&itool=toolbar
2. BARCODE OF LIFE DATA SYSTEMS. BOLDSYSTEMS.org
http://www.boldsystems.org./views/login.php
FUNGAL DATABASE
3. CBS. KNAW FUNGAL BIODIVERSITY CENTRE. http://www.cbs.knaw.nl/
4. MYCOBANK:
http://www.mycobank.org
→
search
5. Bibliography of Systematic Mycology
6. CyberLiber
7. Biodiversity Heritage Library
8. Index Fungorum
Etc. etc.,
OTRAS BASES:
6

7. 9. ITIS. Integrated Taxonomic Information System.
http://www.itis.gov/index.html
Welcome to ITIS, the Integrated Taxonomic Information System! Here you will find
authoritative taxonomic information on plants, animals, fungi, and microbes of North
America and the world. We are a partnership of U.S., Canadian, and Mexican agencies
(ITIS-North America); other organizations; and taxonomic specialists. ITIS is also a
partner of Species 2000 and the Global Biodiversity Information Facility (GBIF). The
ITIS and Species 2000 Catalogue of Life (CoL) partnership is proud to provide the
taxonomic backbone to the Encyclopedia of Life (EOL).
10. Google Scholar
11. BIOSIS, Biological abstracts
12. CABI
13. Agrícola
Etc., etc.
Referencias
Ahrens, U., and E. Seemüller. 1992. Detection of DNA of plant pathogenic mycoplasmalike
organisms by polimerase chain reaction that amplifies a sequence of the 16s rRNA
gene. Phytopathology 82: 828-832.
White, T.J., T. Bruns, S. Lee, and J. Taylor. 1990. Amplification and Direct Sequencing of
Fungal Ribosomal RNA Genes for Phylogenetics. In: PCR Protocols: A Guide to
Methods and Applications. MA Innis, D. H. Gelfand, J. J. Sninsky, and T. J. White
(eds). Academic Press, San Diego, CA. USA. pp: 315-322.
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