En este estudio mostramos los resultados de identificar y cuantificar Coxiella burnetii a partir de productos del aborto y la secrecion vaginal en bovinos con infección natural empleando un novedoso formato de PCR en tiempo real que hemos denominado “ZEN GelMix Real Time PCR” .- Aislar, identificar y caracterizar las cepas de Coxiella burnetii obtenidas a partir de los casos positivos en qPCR - Y conocer el impacto sobre la contaminación ambiental debido a la viabilidad y los títulos de esta bacteria en casos de aborto bovino.

1. ABORTO BOVINO pOR COXIELLA BURNETII
DIAgNósTICO mEDIANTE pCR EN TIEmpO REAL
y EL AIsLAmIENTO mICROBIOLógICO
VILLA ALEIDA; ARNAL JL; sERRANO JD; BENITO AA.
EXOpOL AUTOVACUNAs y DIAgNósTICO. pOL. RíO gáLLEgO, 50840 sAN mATEO DE
gáLLEgO, ZARAgOZA, EspAñA.
XVII CONgREsO INTERNACIONAL ANEmBE
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2. INTRODUCCIóN
La manifestación clínica principal en los rumiantes es el aborto en el último tercio de
gestación con presencia de la C. burnetii en la placenta y los fetos abortados.
También hay indicios de que es causa de infertilidad y metritis.
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3. OBJETIVOs
1.- identificar y cuantificar Coxiella burnetii a partir de productos del aborto y
la secrecion vaginal en bovinos con infección natural empleando un
novedoso formato de PCR en tiempo real que hemos denominado “ZEN
GelMix Real Time PCR”
2.- Aislar, identificar y caracterizar las cepas de Coxiella burnetii obtenidas
a partir de los casos positivos en qPCR
3.- Conocer el impacto sobre la contaminación ambiental debido a la viabilidad
y los títulos de esta bacteria en casos de aborto bovino

4. ZEN gEL mIX COXIELLA BURNETII REAL TImE pCR
 TARGET
Es una PCR en tiempo real
(qPCR) dirigida a trasposones de
C. burnetii, una región especie
específica que codifica factores
de virulencia presentes en todas
las cepas conocidas de este
agente
 LA SONDA
Contiene (5’FAM/ZEN/3’IBFQ).
Se trata de un nuevo tipo de
“sonda ZEN” con doble quencher
FORMATO GEL MIX
En este kit todos los componentes de la reacción
(máster mix, enzimas, cebadores específicos,
sonda, control interno y buffer) han sido
estabilizados dentro de la placa mediante la
tecnología conocida como GELIFICACIÓN
permitiendo su uso a temperatura ambiente y en
formato “ready to use”
(ES patente 02/0010)
CUANTIFICACIÓN
(US Patente serial Nº 7,439,341)
Un fragmento de 200 bp sintético en formato GBlock
y contentivo de 106
copias/ µl fue empleado como
control positivo y de cuantificación

5. Zen Gel mix Coxiella burnetii real time pCr
EXTRACCIÓN DE ADN
La extracción de ADN se realizó
con “Genomic mini Kit LGD 500 y
perlas metálicas de 4mm y el
equipo automatizado “LabTurbo
36 Compact System C3620”
(Taigen Bioscience Corporation)
CONTROL DE CALIDAD del ADN
La pureza y la cuantificación
se realizó mediante espectrofotometría
con el Nanodrop
(Quawell UV Q5000 software 4.0)
AMPLIFICACIÓN
qPCR SETUP:
Zen qPCR
Coxiella Gel Mix
Agua
DNA/RNA free 15µL
PERFORMANCE
DNA molde 5
µL (≥ 0,1 ng/µl)
MiniOpticon real-time System CFB 3120
BIO-RAD. Software CFX manager 2.1
Y otros 6 Thermocycler.

6. validaCión

7. Cultivo miCrobiolóGiCo

8. resultados

9. FIG 1 FIG 2
FIG 3 FIG 4
SenSibilidad eSpecificidad y preciSión de la qPCR

10. abortoS bovinoS

11. Valor umbral en qPCR de las muestras clínicas de abortos y los
equivalentes genómicos de C. burnetii viables recuperados en cultivo
Cq medio= 25,2
Cuantificación absoluta: valor medio 1,6x108
-1,6x107
de tejido fetal g-1
ó
secreciones ml-1

12. aiSlamiento microbiologico
c. burnetii. patogenecidad en embrioneS de pollo
c. burnetii. patogenecidad en embrioneS de pollo
C. Burnetii
fue
recuperada
en fase I en
el 80,96% de
los casos
positivos con
alta
patogenecida
d para los
embriones de
pollo.
La DL50<10 equivalentes genómicos de bacteria.

13. C. burnetii fase i
inmunofluoresCenCia indireCta
C. Burnetii fue recuperada en fase I en el 80,96%
de los casos positivos con alta patogenecidad para
los embriones de pollo.
aislamiento miCrobiologiCo .
identifiCaCión Con mAbs.

14. disCusión
La implicación de los
profesionales veterinarios es crucial
para controlar esta zoonosis, y limitar
sus devastadores efectos en la
industria alimentaria, la Sanidad Animal
y la Salud Pública. El alto número de
casos de abortos positivos a C.
burnetii encontrados en este estudio
justifican incluir esta entidad en el
paquete de declaración obligatoria y
establecer estrictas medidas de
control y programas de vacunación.
C. burnetii fue detectada en 30% de los
casos de aborto y en el 71% de ellos la
bacteria fue recuperada en fase I con alta
patogenecidad en los embriones de pollo.
Estos datos demuestran que la infección
por C. burnetii en el ganado tiene un
gran impacto en la contaminación del
medio ambiente siendo una fuente de
infección para los humanos tengan o no
contacto directo con los animales
infectados

15. ConClusiones
1.- La ZEN GelMix C. burnetii Real Time PCR es un sistema de alta
especificidad y sensibilidad eficientemente validado para el diagnóstico rápido y
de rutina de C. burnetii.
2.- La población de C. burnetii viables diseminadas a través de fomites
durante el aborto de bovinos comporta un grave impacto sobre la contaminación
ambiental y demanda actuaciones urgentes para el control de esta zoonosis
emergente.
3.- Las cepas de campo de C. burnetii procedentes de abortos, identificadas,
caracterizadas y cuantificadas mediante qPCR en este estudio son un material
biológico valioso para otros estudios epidemiológicos, la evaluación de nuevos
inactivantes, desinfectantes, vacunas y antibióticos dentro del programa de
control.

16. Nuestro agradecimiento al Centro Nacional de Microbiología del
Instituto de Salud Carlos III de Madrid, especialmente a la Dra.
Isabel Jado y al Dr Pedro Anda por el ADN de las cepas de
referencia de Coxiella burnetii y el genotipado de las cepas de
campo.
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