Deteción y cuantificación de las células productoras de γ IFN mediante citometría de flujo en muestras de sangre entera de cerdos categorizados oficialmente como libres de PRRS y en cerdos con diagnóstico positivo de la enfermedad. Comparación de la respuesta celular al γ IFN tras la activación policlonal y la activación antígeno específico.

1. Cuantificación del γ interferón intracelularCuantificación del γ interferón intracelular
inducido porinducido por el virusel virus PRRS mediante la citometríaPRRS mediante la citometría
de flujode flujo..
*Aleida Villa Espinosa; Alberto Morillo Alujas1
y Jesús Mateo Querol2
EXOPOL. Autovacunas y Diagnóstico. Pol. Río Gállego, 50840 San
Mateo de Gállego, Zaragoza. Tel 976 694525, exopol@exopol.com.
1
Test & Trials C/ San Isidro 8, 22540 Altorricón, Huesca. Tel
655854765 alujas@testandtrials.com.
2
Piensos ACOGA S.A. Tel 976 661429

2. ObjetivosObjetivos
 Detectar y cuantificar las células productoras de γ IFN
mediante citometría de flujo en muestras de sangre entera
de cerdos categorizados oficialmente como libres de PRRS y
en cerdos con diagnóstico positivo de la enfermedad.
 Comparar la respuesta celular al γ IFN tras la activación
policlonal y la activación antígeno específico.
Dr. Aleida Villa

3. Material y MétodosMaterial y Métodos
Animales
 Los cerdos negativos a PRRS fueron seleccionados con edades entre 2 – 6 meses, de una
empresa clasificada como libre (n = 36), con los criterios:
- Historial epidemiológico .
- Exámenes seriados negativos de la PCR .
- Serología seriada negativa con ELISA de bloqueo.
 Los cerdos positivos a PRRS adultos fueron seleccionados de áreas endémicas, (n = 26),
con los criterios:
- Síntomas clínicos de afección respiratoria con viremia positiva (PCR e Inmunoperóxidasa) y anticuerpos
positivos en un ELISA de bloqueo.
- Síntomas clínicos de afección respiratoria con viremia positiva (PCR e Inmunoperóxidasa) y anticuerpos
negativos en un ELISA de bloqueo.
- Animales aparentemente sanos con viremia negativa (PCR e Inmunoperóxidasa) y anticuerpos positivos
en un ELISA de bloqueo.
- Animales aparentemente sanos con viremia positiva (Inmunoperóxidasa) y anticuerpos positivos en un
ELISA de bloqueo.

4.  Se utilizó un citómetro de flujo de tres
colores FACScan-Becton Dickinson con
un láser ión-argón.
 El control de calidad se realizó con el
estándar CaliBRITE 3
BFA 10 µg / ml
PMA 15 ng / ml
Io 500 ng / ml
PRRSV 1 DI50CT titulo 10-6,2
en MA-104 (HIPRA)
IPX con mAb AC7+AC5 anti NP + gGp5 (INGENASA)
mAb PE P2G10 anti γ IFN porcino 0,025 µg / ml
mAb P2G10 anti γ IFN porcino 0,025 µg / ml
Dr. Aleida Villa

5. ResultadosResultados
Adquisición de los datos
Plantilla utilizada para la adquisición de las células activadas
en cultivo de sangre entera. La adquisición se realizó en dot
plot sobre FSC / SSC e histograma en Fluorescencia 2 (FL2).
Adquisición de sangre entera lisada
y lavada en dot plot sobre FSC / SSC.
Adquisición de sangre entera activada y lisada en
dot plot sobre FSC / SSC. Selección de una región.

6. Evaluación de los Datos
Análisis en CELLQuest Software
30,52%
13,20%
P ≤ 0,001
Comparación de la expresión del γ IFN porcino policlonal
y antígeno específico. Overline de los histogramas
Muestra
positiva γ IFN
Porcino tras
la activación
con el
antígeno viral
Overline del control no activado y el control de bloqueo.
Ubicación del marcador estadístico. Valor KS.
Muestra
positiva γ
IFN porcino
tras la
activación
policlonal
con PMA + Io

7. Evaluación de los datos. Análisis en Pent-A-Gate Software
Adquisición en dot plot sobre
FSC / SSC.
Obsérvese que las células
activadas muestran mayor
complejidad (SSC).
Adquisición en dot plot sobre
SSC / FL2.
El 34,5 % de las celulas
expresan γ IFN (eventos
azules), el 1,6% se ubican en el
borde y el 63,9% son negativas
(eventos verdes).
Reporte de los resultados en histograma.
34,5 % de células que expresan γ IFN

8. Cuantificación de gamma interferón porcino en cerdos
negativosa PRRS
0,00%
5,00%
10,00%
15,00%
20,00%
25,00%
muestras (n = 36)
gamma IFN(PMA+Io) gamma IFN(PRRS) Conttroles negativos
Cuantificación de gamma IFNen cerdos con diagnóstico positivo a PRRS
0,01%
10,01%
20,01%
30,01%
40,01%
50,01%
60,01%
Muestras (n = 26)
%decélulaspositivas
gamma IFN (PMA+ Io) gamma IFN (PRRS) CN
No se detectó ninguna expresión del γ IFN intracelular para
el antígeno viral
(valores ≤ al control negativo). La cuantificación de γ IFN
tras la activación de
la sangre durante 4h a 37º con PMA +Io en presencia de BFA fue de 15,96% ± 4%.
La cuantificación de γ IFN intra-citoplasmático tras la
activación con PMA + Io
en presencia de BFA fue de 45,65% ± 7%, mientras que
la expresión del γ IFN
intracelular para el antígeno viral obtuvo rangos entre
12,3 ± 7%.
Dr. Aleida Villa Espinosa

9. γ IFN
(PMA+Io) γ IFN (PRRS) γ IFN (CN) Clínica ELISA IPX PCR
Interpretación
de PRRS
15,50% 0,90% 0,72% A. sano Negativo Negativa Negativa Negativo
12,30% 1,02% 0,90% A. sano Negativo Negativa Negativa Negativo
19,96% 0,80% 0,36% A. sano Negativo Negativa Negativa Negativo
13,60% 0,95% 0,55% A. sano Negativo Negativa Negativa Negativo
12,70% 0,97% 0,70% A. sano Negativo Negativa Negativa Negativo
19,00% 0,85% 0,43% A. sano Negativo Negativa Negativa Negativo
19,60% 0,76% 0,63% A. sano Negativo Negativa Negativa Negativo
16,70% 1,42% 0,92% A. sano Negativo Negativa Negativa Negativo
18,90% 1,21% 0,96% A. Sano Negativo Negativa Negativa Negativo
17,80% 0,96% 0,82% A. sano Negativo Negativa Negativa Negativo
19,47% 1,00% 0,70% A. sano Negativo Negativa Negativa Negativo
19,30% 1,43% 1,20% A. sano Negativo Negativa Negativa Negativo
17,60% 0,60% 0,92% A. sano Negativo Negativa Negativa Negativo
19,80% 1,50% 0,97% A. sano Negativo Negativa Negativa Negativo
12,80% 0,94% 0,87% A. sano Negativo Negativa Negativa Negativo
18,90% 1,03% 0,93% A. sano Negativo Negativa Negativa Negativo
16,90% 0,43% 1,03% A. sano Negativo Negativa Negativa Negativo
12,30% 0,65% 0,60% A. sano Negativo Negativa Negativa Negativo
19,20% 0,86% 0,82% A. sano Negativo Negativa Negativa Negativo
18,90% 1,10% 0,71% A. sano Negativo Negativa Negativa Negativo
19,10% 0,92% 0,61% A. sano Negativo Negativa Negativa Negativo
16,50% 0,57% 0,88% A. sano Negativo Negativa Negativa Negativo
14,90% 0,40% 1,03% A. sano Negativo Negativa Negativa Negativo
17,90% 1,03% 0,57% A. sano Negativo Negativa Negativa Negativo
15,10% 1,20% 0,94% A. sano Negativo Negativa Negativa Negativo
18,00% 0,85% 0,59% A. Sano Negativo Negativa Negativa Negativo
19,47% 1,20% 0,94% A. sano Negativo Negativa Negativa Negativo
18,00% 0,90% 1,03% A. sano Negativo Negativa Negativa Negativo
19,92% 1,10% 0,96% A. sano Negativo Negativa Negativa Negativo
19,60% 0,68% 0,68% A. sano Negativo Negativa Negativa Negativo
19,72% 0,96% 0,76% A. sano Negativo Negativa Negativa Negativo
19,94% 0,45% 0,90% A. sano Negativo Negativa Negativa Negativo
15,12% 0,69% 0,87% A. sano Negativo Negativa Negativa Negativo
15,87% 1,30% 0,62% A. sano Negativo Negativa Negativa Negativo
19,95% 1,00% 0,93% A. sano Negativo Negativa Negativa Negativo
16,64% 0,82% 1,01% A. sano Negativo Negativa Negativa Negativo
Tabla 1
Interpretación de los resultados de la detección y cuantificación de γ IFN
intra-citoplasmático en los cerdos libres de PRRS

10. γ IFN
(PMA+Io)
γ IFN
(PRRS) γ IFN (CN) Clínica ELISA IPX PCR
Interpretación
de PRRS
36,10% 8,54% 0,82% Enfermo Positivo Positiva Positiva Positivo FASE
32,16% 8,60% 0,60% Enfermo Positivo Positiva Positiva Positivo AGUDA
40,01% 7,40% 0,56% Enfermo Positivo Positiva Positiva Positivo
38,60% 12,52% 0,75% Enfermo Positivo Positiva Positiva Positivo
38,85% 7,32% 0,79% Enfermo Positivo Positiva Positiva Positivo
43,12% 7,43% 0,53% Enfermo Positivo Positiva Positiva Positivo
35,90% 10,12% 0,69% Enfermo Positivo Positiva Positiva Positivo
16,70% 6,16% 0,98% Enfermo Negativo Positiva Positiva Positivo FASE
18,90% 8,48% 0,90% Enfermo Negativo Positiva Positiva Positivo AGUDA
17,80% 10,00% 0,92% Enfermo Negativo Positiva Positiva Positivo
19,47% 5,41% 0,73% Enfermo Negativo Positiva Positiva Positivo
19,30% 6,95% 1,05% Enfermo Negativo Positiva Positiva Positivo
50,13% 15,19% 0,82% A. Sano Positivo Negativa Negativa Contacto INFECCIÓN ?
46,34% 20,26% 0,77% A. Sano Positivo Negativa Negativa Contacto INMUNIDAD ?
39,52% 19,00% 0,84% A. Sano Positivo Negativa Negativa Contacto
44,30% 13,20% 0,96% A. Sano Positivo Negativa Negativa Contacto
47,65% 18,16% 0,,83% A. Sano Positivo Negativa Negativa Contacto
39,96% 16,23% 0,95% A. Sano Positivo Negativa Negativa Contacto
40,02% 16,64% 1,02% A. Sano Positivo Negativa Negativa Contacto
37,12% 22,60% 0,71% A. Sano Positivo Negativa Negativa Contacto
31,17% 17,30% 1,06% A. Sano Positivo Negativa Negativa Contacto
38,34% 12,37% 0,98% A. Sano Positivo Negativa Negativa Contacto
41,12% 17,90% 1,04% A. Sano Positivo Negativa Negativa Contacto
46,31% 13,42% 0,59% A. Sano Positivo Negativa Negativa Contacto
48,90% 19,74% 0,99% A. Sano Positivo Positivo ? Positivo FASE CRÓNICA
39,23% 18,42% 1,05% A. sano Positivo Positivo ? Positivo
Tabla 2
Interpretación de los resultados de la detección y cuantificación de γ IFN
intra-citoplasmático en los cerdos con diagnóstico positivo a PRRS
Dr. Aleida Villa

11. ConclusionesConclusiones
1. En los cerdos libres de PRRS no hubo detección de γ IFN antígeno específico y los
valores de γ IFN tras la activación policlonal fue de 15,96% ± 4%.
2. En los cerdos con diagnóstico positivo a PRRS la detección de γ IFN fue de 12,3 ± 7%
y los valores de γ IFN tras la activación policlonal fue de 45,65% ± 7%.
3. La detección y cuantificación de γ IFN intracelular mediante citometria de flujo pudo
discriminar los cerdos positivos de los negativos a PRRS, tras la activación antígeno
específico.
4. En los cerdos negativos y en los positivos a PRRS hubo expresión de γ IFN como
respuesta a la activación policlonal
5. El test de detección y cuantificación de γ IFN intracelular mediante citometría de
flujo es util y recomendamos su aplicación para formar parte de la bateria
diagnóstica de PRRS en áreas libres, áreas de baja prevalencia y donantes de semen,
entre otros.