Inmunocitoquímica

INVESTIGACIONES APLICADAS
Dr. Aleida Villa Espinosa.
www.aleidavillaespinosa.com

IntroducciónIntroducción
La inmunocitología son los estudios que se realizan a nivel celular empleando laLa inmunocitología son los estudios que se realizan a nivel celular empleando la
reacción antígeno- anticuerpo que se enmarcan en el ámbito de lareacción antígeno- anticuerpo que se enmarcan en el ámbito de la
inmunopatología.inmunopatología.
• Identificación morfológica de células eucariotas y protocariotasIdentificación morfológica de células eucariotas y protocariotas
• Identificación y caracterización de células tumoralesIdentificación y caracterización de células tumorales
• Estudios del ciclo celularEstudios del ciclo celular
• Apoptosis celularApoptosis celular
• Estudios del citoesqueletoEstudios del citoesqueleto
• Estudios de organelosEstudios de organelos
• Carga antigénica tanto propia como extrañasCarga antigénica tanto propia como extrañas
• Estudios de citoquinas y otrosEstudios de citoquinas y otros
En el campo de las enfermedades infecciosas constituye una herramienta útilEn el campo de las enfermedades infecciosas constituye una herramienta útil
para el clínico y el epidemiologo ya que amplia las posibilidades de investigaciónpara el clínico y el epidemiologo ya que amplia las posibilidades de investigación
y diagnóstico de los animales vivos con pequeñas muestras en corto tiempo.y diagnóstico de los animales vivos con pequeñas muestras en corto tiempo.
Existe un gran número de moléculas para optimizar la detección de un analitoExiste un gran número de moléculas para optimizar la detección de un analito
particular a nivel celular. En el mismo nivel se incluyen los fluorocromos, lasparticular a nivel celular. En el mismo nivel se incluyen los fluorocromos, las
enzimas, la biotina y el oro entre otros.enzimas, la biotina y el oro entre otros.
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mm

MuestrasMuestras
• Fluidos corporales.Fluidos corporales.
• Cepillados y raspados.Cepillados y raspados.
• Hisopos con medio de transporte.Hisopos con medio de transporte.
• Organos y fragmentos de tejidos.Organos y fragmentos de tejidos.
• Biopsias por aspiración.Biopsias por aspiración.
• LavadosLavados
• Frotis e improntas superficiales.Frotis e improntas superficiales.
• Extensiones sanguinéas.Extensiones sanguinéas.
• HecesHeces
• Sangre enteraSangre entera

Fluidos corporalesFluidos corporales
– Cavidad pleural, peritonial pericardioCavidad pleural, peritonial pericardio
– Fluidos fetalesFluidos fetales
– Fluidos sinoviales y cerebro espinales.Fluidos sinoviales y cerebro espinales.
– Semen, orina, leche y otrosSemen, orina, leche y otros
- Los fluidos de cavidades corporales se aspiran con pipeta o jeringas y se
ponen en un tubo con anticoagulante.
- Para fluidos cerebroespinales y sinoviales es necesario PBS, o SSF.
- El semen se remite fresco o congelado. Las células somáticas portadoras
de Ag se extraen del semen mediante ISM
- En las células somáticas de la leche podemos estudiar las infecciones que por esta vía se
eliminan. La leche no debe tener conservantes ni colorantes.
- En la orina podemos encontrar células inflamatorias, neoplásicas, decamación
epitelial, microorganismos. Interesa sobre todo el sedimento.
- Todas las muestras se deberán recoger estérilmente si se precisa aislamiento de
microorganismos
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Cepillados, raspados e hisoposCepillados, raspados e hisopos
con medios de transporte.con medios de transporte.
• Son adecuados para las superficies planas y las estructuras tubulares como elSon adecuados para las superficies planas y las estructuras tubulares como el
colon, el recto la pared vaginal y cervical, cavidad nasal y otroscolon, el recto la pared vaginal y cervical, cavidad nasal y otros
• Los órganos revisados durante la necopsia pueden ser muestreados conLos órganos revisados durante la necopsia pueden ser muestreados con
escobillones y cepillosescobillones y cepillos
• Cuando se realizan con espátulas y cepillos citológicos, puede recogerse granCuando se realizan con espátulas y cepillos citológicos, puede recogerse gran
cantidad de material que se debe transferir a frascos de pequeños volumenescantidad de material que se debe transferir a frascos de pequeños volumenes
contentivos de SSF, PBS, Hank’s o similar.contentivos de SSF, PBS, Hank’s o similar.
• Los escobillones que tienen medios de transporte no nececitan otroLos escobillones que tienen medios de transporte no nececitan otro
conservante y son idóneos además para el aislamientode los microorganismosconservante y son idóneos además para el aislamientode los microorganismos

• Los órganos y fragmentos de tejidos se remiten al laboratorio refrigerados oLos órganos y fragmentos de tejidos se remiten al laboratorio refrigerados o
congelados, y embalados individualmente en recipientes adecuados.congelados, y embalados individualmente en recipientes adecuados.
• si los fragmentos de tejidos son muy pequeños deberán ponerse en un frascosi los fragmentos de tejidos son muy pequeños deberán ponerse en un frasco
con tapa contentivo de PBS, SSF o similar, nunca en formalina.con tapa contentivo de PBS, SSF o similar, nunca en formalina.
• Las biopsias por aspiración son adecuadas para masas de tejidosLas biopsias por aspiración son adecuadas para masas de tejidos
debidamente localizadas y diagnosticadas en el animal vivo.debidamente localizadas y diagnosticadas en el animal vivo.
• La biopsia por aspiración se realiza con agujas finas Nº 22 y jeringas de 5 ó 10La biopsia por aspiración se realiza con agujas finas Nº 22 y jeringas de 5 ó 10
ml. Debe aspirarse el material dentro de la aguja nunca en la jeringa.ml. Debe aspirarse el material dentro de la aguja nunca en la jeringa.
Organos, fragmentos de tejidos yOrganos, fragmentos de tejidos y
biopsias por aspiración.biopsias por aspiración.

Lavados, frotis, improntas superficialesLavados, frotis, improntas superficiales
y extesiones sanguíneas.y extesiones sanguíneas.
• Las células pueden exfoliarse de superficies tales como la traqueobronqueal, cavidadLas células pueden exfoliarse de superficies tales como la traqueobronqueal, cavidad
nasal, vagina , próstata y otros, mediante lavados con suero fisiológico estéril onasal, vagina , próstata y otros, mediante lavados con suero fisiológico estéril o
similar, recogiéndose el líquido con pipetas, varillas o jeringas.similar, recogiéndose el líquido con pipetas, varillas o jeringas.
• Los frotis de improntas superficiales son utiles para lesiones de tejidos blandos y laLos frotis de improntas superficiales son utiles para lesiones de tejidos blandos y la
búsqueda de bacterias. Se debe escurrir el tejido sobre un porta objeto limpio, sebúsqueda de bacterias. Se debe escurrir el tejido sobre un porta objeto limpio, se
dejan secar y se remiten al laboratorio envueltos individualmente.dejan secar y se remiten al laboratorio envueltos individualmente.
• Las extensiones sanguineas pueden ser finas o gruesas, Las primeras se empleanLas extensiones sanguineas pueden ser finas o gruesas, Las primeras se emplean
para estudiar los hematies, si se tiene práctica es ventajoso remitir los potaspara estudiar los hematies, si se tiene práctica es ventajoso remitir los potas
realizados al laboratorio. Si se sospecha de hemoparásitos se realizan de la venarealizados al laboratorio. Si se sospecha de hemoparásitos se realizan de la vena
marginal de la oreja preferentemente. Las extensiones gruesas sirven para estudiarmarginal de la oreja preferentemente. Las extensiones gruesas sirven para estudiar
las pobaciones leucocitarias. La sangre necesita anticoagulante si no se realizan en ellas pobaciones leucocitarias. La sangre necesita anticoagulante si no se realizan en el
acto de extracción.acto de extracción.

Sangre para cultivos de linfocitos y HecesSangre para cultivos de linfocitos y Heces
• Los cultivos de células mononucleares son útiles para estudiarLos cultivos de células mononucleares son útiles para estudiar
portadores de infecciones, viremias, inmunidad celular y otrosportadores de infecciones, viremias, inmunidad celular y otros
• La sangre se recoge en tubos estériles con heparina y antes de las 24La sangre se recoge en tubos estériles con heparina y antes de las 24
h. de extracción debe estar en el laboratorio.h. de extracción debe estar en el laboratorio.
• Las heces son una vía importante de eliminación de antígenos,Las heces son una vía importante de eliminación de antígenos,
microorganismos y detritus celulares. Para la recuperación ymicroorganismos y detritus celulares. Para la recuperación y
concentración se emplea la ISM. Las muestras de heces se recogenconcentración se emplea la ISM. Las muestras de heces se recogen
directamente del recto y se remiten en pequeños frascos o bolsas.directamente del recto y se remiten en pequeños frascos o bolsas.
• Los cultivos de células mononucleares son útiles para estudiarLos cultivos de células mononucleares son útiles para estudiar
portadores de infecciones, viremias, inmunidad celular y otrosportadores de infecciones, viremias, inmunidad celular y otros
• La sangre se recoge en tubos estériles con heparina y antes de las 24La sangre se recoge en tubos estériles con heparina y antes de las 24
h. de extracción debe estar en el laboratorio.h. de extracción debe estar en el laboratorio.
• Las heces son una vía importante de eliminación de antígenos,Las heces son una vía importante de eliminación de antígenos,
microorganismos y detritus celulares. Para la recuperación ymicroorganismos y detritus celulares. Para la recuperación y
concentración se emplea la ISM. Las muestras de heces se recogenconcentración se emplea la ISM. Las muestras de heces se recogen
directamente del recto y se remiten en pequeños frascos o bolsas.directamente del recto y se remiten en pequeños frascos o bolsas.

Localización de antígenosLocalización de antígenos
intra y extra celularesintra y extra celulares
Células presentadoras de antígenos. (CPA)
Tipo celular Localización
Monocitos Sangre
Macrófagos Tejidos
Zona marginal de macrófagos Bazo y ganglios linfáticos
Células de Kupffer HígadoCPA fagocitos
Microglia Encéfalo
Células de Langerhans Piel
CPA no fagocitos
Células dendríticas interdigitating Tejido linfoide
CPA linfocitos Linfocitos B y T Tejido linfoide y sitios de
inmunoreacción
Astrocitos Encéfalo
Células foliculares Tiroide
Células endoteliares Vascular y tejido linfoide
CPA facultativas
Fibroblastos Tejido conectivo.
mm

Localización de Antígenos intra y extra celularesLocalización de Antígenos intra y extra celulares
Células diana de la infección. (CD)Células diana de la infección. (CD)
• Son células diana de una infección aquellas donde seSon células diana de una infección aquellas donde se
multiplican o replican o transportan los microorganismos.multiplican o replican o transportan los microorganismos.
• La célula diana depende de la calidad y cantidad de losLa célula diana depende de la calidad y cantidad de los
receptores específicos a un microorganismo dado o a susreceptores específicos a un microorganismo dado o a sus
antígenos.antígenos.
• El tropismo de un microorganismo por una célula dependeEl tropismo de un microorganismo por una célula depende
del tipo celular, especie, edad, raza y especialización.del tipo celular, especie, edad, raza y especialización.
• El nivel de detección de los antígenos microbianos enEl nivel de detección de los antígenos microbianos en
células dianas está relacionado con el tipo de replicación océlulas dianas está relacionado con el tipo de replicación o
curva de multiplicación, estructura antigénica, localización,curva de multiplicación, estructura antigénica, localización,
formas clínicas y vías de eliminación.formas clínicas y vías de eliminación.

Seroteca. Base de datos y paneles
Anticuerpos monoclonales. (mAb)
• Nombre completo incluido nº de referencia y autor
• Centro proveedor e investigador de contacto
• Denominación de hibridoma
• Denominación del clón
• Antígenos de reconocimiento: ( Género esp., Epítopos esp., Reacciones
cruzadas)
• Presentación: sobrenadante de cultivos o líquido ascítico
• Purificación ( preferentemente por afinidad)
• Concentración en mg/ml
• Clase y subclase de Ig, si es la molécula completa, Fab', Fc
• Vida media en la conservación
• Guardar en alícuotas en volúmenes de 10 - 20 µl en crioviales y etiquetas propias
• Certificación de análisis
• Referencias bibliográficas
mm

Seroteca. Base de datos y paneles
Anticuerpos policlonales
• Nombre completo, incluido código y nº de producto
• Centro proveedor e investigador de contacto
• Huésped
• Tipo de adsorción
• Especificidad: monoespecífico, reacción cruzada
• Purificación: preferentemente afinidad
• Clase y subclase de Ig
• Guardar en alicuatas por 10- 20 µl en crioviales bien identificados con
etiquetas propias
• Aplicaciones
• Concentración en mg/ml
• Vida media y forma de conservación
• Certificado de análisis
• Referencias bibliográficas
• Validaciones periódicas con sistemas propios.

Ejemplo de información técnica
en la Seroteca
INVESTIGADORES DE CONTACTO.
N.H.S. Swellengrebel.
Laboratory of Tropical Hygiene.
H. van de Kemp.
Biomedical Research
CENTRO PROVEEDOR
Royal Tropical Institute and WHO/FAO
Collaborating Centre for Reference and
reserarch on Leptospirosis.
MAb. Leptospira autumnalis Clone F65C3 Grupo específico:
serovares:autumnalis,bangkinan
g, bim, bulgaria, butembo,
carlos, erinac.aur, fostbragg,
lambwe, mooris,mujunkumi,
weerasinghe,
MAb. Leptospira canicola Clone F 152C8 serovar: canicola
MAb. Leptospira icterohaemorrahagiae Clone F70C14 serovar:
icterohaemorragiae
MAb. Leptospira grippotyphosa Clone F71C3 serovar grippotyphosa
MAb. Leptospira sejroe Clone F13A3 serovar hardjo
MAb. Leptospira australis Clone F90C12 serovar bratislava
MAb. Leptospira pomona Clone F43C9 Grupo específico:
pomona, mozdok, proechimys,
trópica

Anticuerpos monoclonales. Están disponibles en el mercado, La lista
puede ser tan amplia como queramos
ADV gE - gB BHV-1 gE - gB
Campylobacter fetus Toxoplasma gondii
Enterovirus Papilomavirus
Parvo virus PRRS
Pasterella toxigénica Rotavirus
Influenza tipo A Coronavirus bovino
Coronavirus respiratorio TGE
PEDV Brachyspira hyodisenteriae
Brachyspira pilosicoli Lawsonia intracelularis
Chlamydia Leptospiras
Neospora BRSV
BVD p80; p80/125; gp57 PI3
Tuberculosis Encephalitrozoon
RHD
Visna Maedi /CAE
Mixomatosis
Adenovirus

Anticuerpos policlonales
Brachyspira spp
Paratuberculosis
Listeria monocitógenes
Erysipelotrix rhusiopathiae
Cándida albicans
Clostridium novyi
Clostridium sordelii
Clostridium chauvoei
Clostridium septicum
Mycoplasmas:hyopneumoniae, hiorhinis, hyosinoviae
bovis, agalactiae, ovipneumoniae
arginini, capricolum, capri F38
mycoides sc y sl, putrefasciens
Iowae, gallisepticum, synoviae
Meliagridis, pulmonis

ProtocoloProtocolo
para lapara la
identificaciónidentificación
de Antígenosde Antígenos
en células.en células.

Resultados de la preparación de célulasResultados de la preparación de células
aisladasaisladas
Monocapas de células Inmunoperóxidasa.Monocapas de células Inmunoperóxidasa.
Controles negativosControles negativos

• Unión inespecífica de las inmiunoglobulinas ( Ig ) a los receptores FCUnión inespecífica de las inmiunoglobulinas ( Ig ) a los receptores FC
Los receptores FC son glicoproteínas de la membrana con alta afinidad por polímeros yLos receptores FC son glicoproteínas de la membrana con alta afinidad por polímeros y
complejos inmunes de Ig. A veces se hace necesario bloquear los sitios reactivos de FC encomplejos inmunes de Ig. A veces se hace necesario bloquear los sitios reactivos de FC en
los tejidos para impedir la unión inespecífica de las Inmunoglobulinas a los tejidos.los tejidos para impedir la unión inespecífica de las Inmunoglobulinas a los tejidos.
SoluciónSolución: La mas frecuente es la utilización de suero norma l o emplear la fracción Fab` de: La mas frecuente es la utilización de suero norma l o emplear la fracción Fab` de
las Ig y no las moléculas completaslas Ig y no las moléculas completas
• Enzimas endógenasEnzimas endógenas
La presencia de peróxidasa endógena es una causa frecuente de background.Los tejidosLa presencia de peróxidasa endógena es una causa frecuente de background.Los tejidos
de mamíferos a veces exhiben actividad peróxidasa, particularmente las hemoproteínas.de mamíferos a veces exhiben actividad peróxidasa, particularmente las hemoproteínas.
SoluciónSolución:: La destrucción enzimática ccon peróxido de hidrógeno.La destrucción enzimática ccon peróxido de hidrógeno.
• Interacción hidrofóbicaInteracción hidrofóbica ::
La hidrofobocidad es una propiedad que poseen muchas proteínas. Las inmunoglobulinasLa hidrofobocidad es una propiedad que poseen muchas proteínas. Las inmunoglobulinas
son paticularmente hidrofóbicas sobre todo cuando se emplean fijadores que contienenson paticularmente hidrofóbicas sobre todo cuando se emplean fijadores que contienen
aldehidos tales como la formalina y el glutaraldehido.aldehidos tales como la formalina y el glutaraldehido.
SoluciónSolución:: Optimizar la fijación en tiempo,temperatura y pH. Emplear agentesOptimizar la fijación en tiempo,temperatura y pH. Emplear agentes
bloqueadores antes del primer anticuerpo, buffer de baja fuerza iónica y detergentes.bloqueadores antes del primer anticuerpo, buffer de baja fuerza iónica y detergentes.
Puntos críticos en la inmunotinciónPuntos críticos en la inmunotinción

Algunos EjemplosAlgunos Ejemplos
Brachyspiras obtenidas por ISMBrachyspiras obtenidas por ISM
e identificadas en IPXe identificadas en IPX
con anticuerpos monoclonalescon anticuerpos monoclonales

EjemplosEjemplos
Identificación de bacterias, levaduras y parásitosIdentificación de bacterias, levaduras y parásitos
mediante IPX con anticuerpos monoclonales y policlonalesmediante IPX con anticuerpos monoclonales y policlonales

Algunos EjemplosAlgunos Ejemplos
Localización de antígenos virales en diferentes tipos de célulasLocalización de antígenos virales en diferentes tipos de células
mediante Inmunoperóxidasa con anticuerpos monoclonalesmediante Inmunoperóxidasa con anticuerpos monoclonales

Otros métodosOtros métodos
Para el desarrollo de la inmunocitología estamos estudiando laPara el desarrollo de la inmunocitología estamos estudiando la
fluorimetría y la citometría de flujo de barrido láser.fluorimetría y la citometría de flujo de barrido láser.

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