En este trabajo se discuten los métodos de cultivo , identificación, diferenciación serologica y la cuantificación de los Mycoplasmas vehiculizados en la leche de ovejas y cabras.

1. Aislamiento e identificación deAislamiento e identificación de
Mycoplasmas spMycoplasmas sp..
a partir de leches de ovejas y cabras.a partir de leches de ovejas y cabras.
INVESTIGACIÓN APLICADAINVESTIGACIÓN APLICADA
Aleida Villa EspinosaAleida Villa Espinosa
Ana B. Fernández RosAna B. Fernández Ros
I + D + iI + D + i

2. Taxonomia de la claseTaxonomia de la clase MollicutesMollicutes
• Orden Mycoplasmatales
• Familia Mycoplasmataceae :
Género Ureaplasma
Género Mycoplasma
• Orden Acholeplasmas
• Familia Acholeplasmataceae
Género Acholeplasma
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3. Diferenciación de los géneros deDiferenciación de los géneros de
la clasela clase MollicutesMollicutes
Géneros Tamaño de
las colonias
Prueba de
la digitonina
Prueba de
la ureasa
Acholeplasma Grandes 0,8mu Negativa < 3mm Negativa
Ureaplasma Muy pequeñas
0,1mu
Positiva > 5mm Positiva
Mycoplasma Variable Positiva> 5mm Negativa
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4. AcholeplasmasAcholeplasmas
• Acholeplasma sp.
• Cuando los cultivos exhiben
colonias grandes, negativas a
la prueba de la digitonina con
buena multiplicación en el
medio agar acholeplasma.
•
(Todos los cultivos con halos de difusión <
5mm se pasarán a este medio selectivo.)
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5. UreaplasmasUreaplasmas
• Ureaplasma sp.
Se confirma cuando las
pruebas de la digitonina y la
ureasa son positivas y las
colonias crecen bien en el
medio agar urea, con o sin
ambiente de CO2.
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6. Mycoplasma sp.Mycoplasma sp.
Los artefactos son el principal
problema en la detección de
Mycoplasmas.
Las bacterias, las células y los
detritus celulares suelen parecer
colonias con forma de huevo fritos.
Algunos lotes de sueros inducen la
formación de pseudo colonias que son
cristales de lípidos que aparecen en la
superficie, pero no generan productos
metabólicos.
El laboratorio tiene que demostrar que:
-el agente encontrado es transferible
-que tiene curva de crecimiento
logarítmico aceptable
.y tinciones permanentes.
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7. MycoplasmasMycoplasmas verdaderos.verdaderos.
Tinción de Dienes
Las pseudocolonias y las formas L de
bacterias decoloran en < de 30 min.
Mycoplasmas adquieren tinción
permanente > 24 horas.
• Mycoplasma sp. -Los aislados
digitonina positivo, urea negativo, Dienes
permanentes > 24 horas, serán
identificados como Mycoplasma sp.
• Los aislamientos con colonias
decoloradas en menos de 30 minutos,
serán eliminados.
• Si queremos revertir las formas L de
bacterias 5 pases sucesivos en medio
líquido sin antibióticos y sin acetato de
talio, intercalando con agar sangre y
agar Mc Conkey.
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8. Medios de cultivo estudiadosMedios de cultivo estudiados
Composición y característicasComposición y características
Caldo EATON`S modificado Caldo PPLO
Caldo PPLO Caldo PPLO
Extracto de levadura fresca Extracto de levadura fresca
Suero equino inactivado Suero equino inactivado
Ampicillina sódica Ampicillina sódica
Acetato de talio Acetato de talio
SSB Hank`s Glucosa
Colesterol / Tween 80 HEPES buffer
DNA
Pyruvato de sodio
Rojo fenol
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9. Medios de cultivo estudiadosMedios de cultivo estudiados
Composición y característicasComposición y características
Agar Mycoplasma Agar PPLO
Agar PPLO Difco Agar Mycoplasma Oxoid
Extracto de levadura fresca Extracto de levadura fresca
Suero equino Suero equino
Ampicillina sódica Ampicillina sódica
Colesterol / Tween 80 Glucosa
HEPES buffer
DNA
Pyruvato de sodio
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10. Caldo PPLO
Agar PPLO Resultados MB
Film + colonias
Agar Mycoplasma Resultados MB
Solo film
Caldo EATON`S
Agar PPLO Resultados B
Agar Mycoplasma Resultados B
Sensibilidades aceptadas en los
sistemas de detección directa de
Mycoplasmas en UFC / ml
Real Time PCR(2-10 EG/runs) 1,5
Cultivo en agar 100-300
ELISA 10 000
Inmunoblot 100 000
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11. Identificación cultural y bioquímica de especies de Mycoplasmas de
leche de ovejas y cabras. Estudio de 9 aislados.
Aislados Crecimiento
caldo PPLO
pH ≠0,5 u.
Crecimiento
agar PPLO
UFC/ 50 µl
Crecimiento
agar
EATONON`S
UFC/ 50 µl
Formación de
film / spot
Hidrólisis del suero
LO 1 ++++ > 1010
> 1010
Positivo Negativo
LO 9 ++++ 106
106
Positivo Negativo
LCa 17 +++ 109
109
Positivo Negativo
LO 2 +++ 104
104
Positivo Negativo
LO 7 +++ 102
102
Positivo Negativo
LCa 18 ++++ 106
106
Positivo Negativo
45801 ++++ 102
102
Positivo Negativo
LO 5 ++++ 107
107
Positivo Negativo
LO 3 ++++ >1010
>1010
Positivo Negativo
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12. Identificación serológica de las especies deIdentificación serológica de las especies de
MycoplasmasMycoplasmas
• La identificación definitiva especie específica del género
Mycoplasma,
se basa en los procedimientos serológicos. Los procedimientos mas
utilizados son:
• - Inhibición del crecimiento - Inmunofluorescencia
• - Inhibición del metabolismo - MF dot Inmunobinding
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13. Factores que afectan la especificidad y sensibilidad deFactores que afectan la especificidad y sensibilidad de
las pruebas serológicaslas pruebas serológicas
1.- Los antígenos de superficie compartidos entre algunas especies de
Mycoplasmas.
• Especies de Mycoplasmas que tienen reacción cruzada:
• - Cluster mycoides Todos sus miembros entre si
• - M. agalactiae y M. bovis.
2.- Muchas especies de Mycoplasma poseen una alta frecuencia de variabilidad
antigénica en los antígenos de superficie.
• Es difícil encontrar anticuerpos que sean simultáneamente representativos y
específicos a todas las variantes antigénicas dentro de una especie.
3.- Los rápidos daños antigénicos provocados durante la práctica usual del
laboratorio: clonación, filtración, sub-cultivación etc. Incluso en las cepas de
referencia.
4.- En la medida que se ha incrementado el número de especies, cada aislado tiene
que ser evaluado con mayor número de sueros.
• La identificación serológica completa de las especies de Mycoplasma es cada
día más laboriosa.
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14. Identificación serológica con InmunodifusiónIdentificación serológica con Inmunodifusión
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