El documento proporciona un curso básico sobre citometría de flujo, explicando su definición, componentes y funcionamiento, incluyendo la importancia de los parámetros medibles como el tamaño y la complejidad celular. Se detalla el proceso de excitación y medición de fluorescencia, así como la selección y compensación de fluorocromos. Finalmente, se abordan aspectos prácticos del uso de anticuerpos en inmunofenotipado y la representación de resultados a través de diversas estrategias gráficas.

1. CURSO BÁSICO DE
CITOMETRÍA DE FLUJO.
Javier Godino.
César Vallejo.
Desirée Perebom
Servicio de separación celular y
citometría
CITOMETRÍA DE FLUJO.
FUNDAMENTOS.
• Que es la citometría de flujo.
• Componentes de un citómetro de flujo.
• Dispersión de la luz.
• Fluorescencia. Fluorocromos, Compensación de
fluorescencias.
• Ventajas e inconvenientes de la citometría de flujo
1

2. ¿Qué es la citometría de flujo?
La citometría de flujo es una técnica que permite
medir simultáneamente múltiples características
ópticas (dispersión de luz y fluorescencia) de cada
una de las células o partículas presentes en una
suspensión.
• Suspensión de células individuales.
- Buffer + EDTA o DNAsa.
- Células en frío.
- Lisados tisulares: Disgregación enzimática + filtrado
• Comprobar que el método de disgregación o recolección
del cultivo no afecta a los parámetros que queremos
medir.
Parámetros medibles
• Directos.
- Tamaño y complejidad celular
• Indirectos. Se añaden a la suspensión celular reactivos con
propiedades ópticas determinadas: FLUOROCROMOS.
- Unión a componentes nucleares: ADN.
- Parámetros metabólicos: pH, concentración de Ca2+
- Unión a proteínas de membrana o intracelulares a través
de anticuerpos conjugados a fluorocromos
2

3. ¿Que es un citómetro?
•Sistema que hace pasar células de una en una haciendo
incidir sobre ellas un láser.
• Mide dispersión frontal (FSC), dispersión lateral (SSC) y
emisión de fluorescencia.
Boquilla de
inyección
Dispersión
Señal fluorescente
Dispersión
Láser incidente
focalizado
Partes de un citómetro de flujo
• Sistema de Fluidos
– Crea un flujo constante de fluido envolvente
– Transporta la muestra al punto de interrogación
– Alinea las partículas de modo que pasen de una en una por
el punto de interrogación
• Óptica
– Focaliza el láser de excitación
– recoge y mide la luz emitida
•
Electrónica
– Convierte la señal óptica en un pulso electrónico
– Envía la señal al procesador para ser analizado
• Software
– Muestra gráficamente los datos
– Controla la configuración del sistema
Sistema de fluidos del
FACSAria
Carro de fluidos
Presión
Plenum
Cámara
Fluido
envolvente
Tubo de
muestra
Basura
3

4. Enfoque hidrodinámico
Muestra
Fluido envolvente
Baja velocidad
de inyección
Muestra
Envolvente
Alta velocidad
de inyección
Enfoque hidrodinámico
El flujo laminar permite mantener las células en el centro
del flujo y evita la formación de turbulencias.
Enfoque hidrodinámico
Flujo laminar
Flujo turbulento
4

5. Enfoque hidrodinámico
10 psi
10 psi
10 psi
10.2 psi
10.4 psi
•
10.8 psi
La diferencia entre las presiones de la muestra y la del
líquido envolvente determina el diámetro del “capilar
virtual”
Enfoque hidrodinámico
Velocidad de muestra alta
(dif. presión alto)
dif.
Velocidad de muestra baja
(dif. presión bajo)
dif.
Haz del láser
Haz láser
Intensidad de luz
Muestra
Líquido de arrastre
400
300
# Cells
Máxima iluminación
CV bajos
200
100
0
10
0
10
1
2
10
CD4 FITC
10
3
10
4
Iluminación variable
CV altos
Óptica de excitación
• Excitación
mediante
fuentes de luz coherentes.
Láseres
• Un sistema de prismas
dirige
la
luz
hacia
la
cámara de flujo.
• Enfoca el láser sobre el
flujo de células
5

6. Óptica de emisión
• Una vez que el láser incide la célula responde emitiendo luz
a varias longitudes de onda, en función de que fluorocromos
hayamos usado → Tenemos que separar la fluorescencia
asociada a cada característica celular: FILTROS
Transmittance
Óptica de emisión: Filtros
400nm
500nm
600nm
700nm
Transmittance
Óptica de emisión: Filtros
400nm
500nm
600nm
700nm
6

7. Transmittance
Óptica de emisión: Filtros
400nm
500nm
600nm
700nm
Óptica de emisión: Espejos
Óptica de emisión
PMT 4
PMT
3
Filtros
Dicroicos
PMT 2
PMT 1
Cámara de flujo
SS
C
FSC
Laser
Bandpass
Filters
7

8. Óptica de emisión
PMT 4
PMT
3
Filtros
Dicroicos
PMT 2
Cámara de flujo
PMT 1
SS
C
FSC
Laser
Bandpass
Filters
Óptica de emisión
Óptica de emisión
PerCP-Cy5.5
PE
FITC
SSC
PE-Txred
PE-Cy7
8

9. Detectores
• Convierten la señal luminosa en corriente eléctrica. La
intensidad de esta señal es proporcional a la luz que llega.
• En citometría se usan de 2 tipos ambos basados en el
efecto fotoeléctrico:
- Fotodiodos de silicio: Los fotones que inciden en una
placa de silicio liberan electrones.
• Menos eficientes se usan para medir la dispersión
frontal (FSC)
- Tubos fotomultiplicadores: Mas eficientes: Se usan para
medir fluorescencias y dispersión lateral (SSC)
Tubo fotomultiplicador
Laser
1
Voltaje
ELECTRONICA
Creación de un pulso de voltaje
2
Laser
Voltaje
Tiempo
3
Laser
Voltaje
Tiempo
Tiempo
9

10. Pulse area(A)
0
40
Pulse Width (W)
10
256
196
1
10,000
1000
3.54 volts
.1
(Volts)
(Volts)
6.21 volts
128
.01
64
.001
(1mV)
100
0
1.23 volts
0
Channel Number
10
Time (µs)
10
Relative Brightness
Voltage
Pulse Height (H)
Área, altura, anchura
1
Umbral de adquisición
(Treshold)
• Eliminamos
las
señales muy bajas que en general
corresponden a restos celulares que no nos interesan
1
256
196
.1
(Volts)
3.54 volts
(Volts)
6.21 volts
128
.01
64
.001
(1mV)
0
1.23 volts
UMBRAL
0
10,000
1000
100
10
Relative Brightness
10
Channel Number
10
1
10

11. Medición del tamaño y la
complejidad celular
Forward scatter
tamaño (488 nm)
Láser (488 nm)
Side scatter
Complejidad (488 nm)
Dispersión frontal (FSC)
Dispersión lateral (SSC)
se mide en la dirección de la luz
incidente (2-5 grados) a la misma
λ
Medido perpendicularmente a
la dirección de la luz incidente a
la misma λ
Relacionado con el tamaño/
superficie celular (relación lineal
sólo para partículas esféricas)
Relacionado con la complejidad
celular (granularidad)
Representación de la
información: Histogramas
Voltaje
Tamaño- FSC
Laser
Tiempo
Representación de la
información: Histogramas
Laser
Voltaje
Tamaño- FSC
Tiempo
11

12. Representación de la
información: Histogramas
Voltaje
Tamaño- FSC
Laser
Tiempo
Representación de la
información: Histogramas
Tamaño- FSC
FSC
Tamaño/Complejidad
Voltaje
Representación de la
información: Diagrama de
puntos
Tamaño
Tiempo
Voltaje
Laser
Complejidad
Tiempo
12

13. Tamaño y complejidad:
Células sanguíneas
Granulocitos
Monocitos
Linfocitos
Debris
Fluorescencia
S2
El fluorocromo absorbe la energía de la luz incidente y
S1
se excita
Disipa la energía absorbida de forma prácticamente
hλ
instantánea:
S0
Vibración y generación de calor
emisión de un fotón de mayor longitud de onda
(menos energético)
Absorción
Emisión
Fluorocromos
Moléculas orgánicas pequeñas.
Isotiocianato
de
fluoresceina
(FITC)
Proteínas.
Ficoeritrina (PE)
13

14. Quantum dots
• Nanoesferas de material semiconductor: Cd
+ Se o Te.
• Rodeadas de ZnS y un polímero orgánico.
• Funcionalizadas
anticuerpos.
para
poder
unirse
a
Quantum dots
• Funcionan como fluorocromos. Al
recibir un fotón emiten otro de mayor
longitud de onda.
• La λ a la que emiten es proporcional
al tamaño del núcleo del material
semiconductor.
Quantum dots
• Ventajas:
- Pico de absorción ancho: Con un
láser excitamos muchos QD.
- Pico de emisión estrecho: Mejor
compensación.
- Más estables.
• Inconvenientes:
- Poca disponibilidad.
- Toxicidad:
pesados.
Liberan
metales
- ¿Conjugación con anticuerpos?,
¿marcaje intracelular?
14

15. Brilliant violet
• Polímeros orgánicos
conductores
• Ultra brillantes. Entre PE y
APC.
• Un solo láser (405) excita
todos los BV
Cytometry Part A 81A: 456466, 2012 PK
Chattopadhyay
Fluorocromos
Intensidad relativa
400 nm
500 nm
600 nm
700 nm
Excitation
Emission
Fluoresceina (FITC)
Fluorocromos
Intensidad relativa
400 nm
500 nm
600 nm
700 nm
Excitation
Emission
Ficoeritrina (PE)
15

16. Intensidad relativa
Fluorocromos
400 nm
500 nm
600 nm
700 nm
Excitation
Emission
Fluoresceina (FITC) Ficoeritrina (PE)
Inmunofenotipado
λ=488 nm
Excitación
λ=520 nm
λ=580 nm
Emisión
16

17. • La fluorescencia emitida por cada fluorocromo o
colorante debido a la excitación por el láser es emitida en
todas direcciones.
• Situamos el detector a 90º para minimizar interferencias.
• La especificidad de la detección está controlada por la
selección de longitudes de onda por parte de espejos y
filtros ópticos.
Láser
Detector FSC
Detector de FLs
(PMT3, PMT4 etc.)
Los citómetros de flujo pueden llevar incorporados diversos
láseres de forma simultanea.
350
300 nm
407 457 488 532
400 nm
500 nm
610 632
600 nm
700 nm
PE-TR Conj.
PETexas Red
PI
Ethidium
PE
FITC
cis-Parinaric acid
cis-
17

18. Compensación de Señales
Fluorescentes
Intensidad Relativa
FITC
PE
488
Longitud de onda
505505-520
570570-590
Compensación de Señales
Fluorescentes
Células marcadas
sólo con FITC
Compensación
de Señales
Fluorescentes
Muestra compensada
F CompensadaPE = F Medida PE - % FFITC
18

19. Compensación de Señales
Fluorescentes
SIN COMPENSAR
COMPENSADA
PE
FITC
Universidad de
Purdue
Compensación de Señales
Fluorescentes
PE
PE
FITC
FITC
El valor de la compensación
depende de la intensidad de
la señal
PE
Universidad de
Purdue
Compensación de Señales
Fluorescentes
• COMP BEADS: Mezcla de bolas de látex de 2 tipos:
- Recubiertas de anticuerpos anti cadena κ.
- “Desnudas”
• Al añadir cualquier anticuerpo con cadenas ligeras κ se
unirá a las partículas recubiertas y no a las desnudas.
• Preparamos tantos tubos como fluorocromos vamos a
usar y encada uno añadimos un anticuerpo con un
fluorocromo diferente
19

20. Compensación de Señales
Fluorescentes.
Comp Beads
• La compensación es correcta cuando la media de la
fluorescencia para PE es igual para las 2 poblaciones
Compensación de Señales
Fluorescentes
• Fluorocromos en tándem
• El desplazamiento de λ entre absorción y emisión es
pequeño:
Limita
los
fluorocromos
utilizables
simultáneamente → FLUOROCROMOS EN TANDEM
Láser
APC
Cy7
Emisión
20

21. • Cuidado con los flurocromos en Tándem. El “fluorocromo
lejano” se puede excitar directamente al pasar por un láser
adecuado.
PE
770 nm
Cy7
Láser azul
PE
770 nm
Cy7
Láser rojo
Fluorocromos en tándem
• Aumenta el número de
fluorocromos
utilizables,
pero se rompen con
facilidad.
0 horas
2 horas
22,5 horas
S.C Bendall et al.
21

22. ASPECTOS PRÁCTICOS
¿Qué fluorocromo uso?
• No
todos
los
fluorocromos
son
igual
de
“buenos”
produciendo fluorescencia.
• Rendimiento cuántico: Cuantos fotones necesita recibir un
fluorocromo para emitir uno → Determina el llamado “indice
de marcado”
Indice de marcado = D / W
D = Diferencia entre la mediana de los picos
W = 2 x SD (Desviación estandar)
CD127 PE
40
35
Stain index
30
25 mW green laser (532 nm)
25
100 mW blue laser (488 nm)
20
25 mW blue laser (488 nm)
15
10
5
0
300 400 500 600 700
PMT voltage
• Hay que elegir la combinación “mas brillante” posible, en
cualquier
caso,
los
fluorocromos
más
brillantes
deben
reservarse para los marcajes más débiles y debe minimizarse la
compensación .
22

23. AUTOFLUORESCENCIA
• Tambien FAD, AA aromáticos, Vit
A….
• Sobre todo azul-verde (FITC).
• Granulocitos, monocitos, linfocitos
activados
Espectro de absorción y
emisión de NAD(P)H
Hay vida más allá de la
fluorescencia: CYTOF
S.C Bendall et al.
Hay vida más allá de la
fluorescencia: CYTOF
23

24. Hay vida más allá de la
fluorescencia: CYTOF
• En teoría + de 100 marcajes simultáneos (contaminación y
oxidación bajan el número) sin necesidad de compensación
• Índice de Marcado peor que los fluorocromos más
brillantes pero muy parecido entre ellos.
• Vmax 1000 cels/seg. Además sólo aprovecha el 30% de
la muestra.
• No FSC/SSC, ni niveles de calcio, división celular………
¿ Que podemos medir
por citometría de flujo?
Metabolitos
Características de la
citometría de flujo
-El análisis es multiparamétrico y simultáneo. - El análisis
se realiza sobre partículas individuales dentro de una
población compleja.
- El análisis se realiza a velocidades de entre 500 y 4000
partículas/segundo lo que resulta en una elevada fiabilidad
estadística (permite analizar poblaciones representadas en
baja frecuencia).
- Se pueden analizar partículas de tamaños 0,5-100 µm
(bacterias, levaduras, células eucarióticas).
24

25. Características de la
citometría de flujo
•El análisis no permite determinar la localización de la
fluorescencia.
• En el caso de células adherentes tenemos que
despegarlas del soporte de cultivo, lo que puede alterar
su fisiología.
• Se consume muestra. La citometría convencional no
permite re-análisis de la misma.
CITOMETRÍA DE FLUJO.
INMUNOFENOTIPADO
• ¿Qué es un anticuerpo?.
• Marcaje
directo
extracelular.
Representación
de
la
información: Histogramas, gráficas de puntos y densidad,
escalas.
• Otras estrategias de marcado: Marcaje intracelular, marcaje
indirecto.
• Controles en inmunofenotipado: Isotipo, biológicos y FMO.
• Bloqueo de receptores Fc
• ¿Cuánto anticuerpo uso?
25

26. • Se basa en la unión específica de los anticuerpos con su
antígeno correspondiente.
• Se generan anticuerpos frente a las proteínas cuya
presencia en la célula queremos determinar y se les acopla
un fluorocromo.
• Si la célula expresa la proteína el anticuerpo se une y
veremos fluorescencia asociada a esa célula
Anticuerpos
• Son glicoproteínas producidas por linfocitos B. Reconocen
con alta afinidad sustancias extrañas y activan la posterior
respuesta inmune.
• Principal Característica: Enorme diversidad.
- Recombinación somática.
- Hipermutación
- Cambio de clase.
• En proteínas reconoce zonas pequeñas (± 7 aa). Se
pueden generar varios anticuerpos misma proteína
Estructura de las
Anticuerpos
inmunoglobulinas
Región
variable
Región
variable
κ, λ
α, δ, ε, γ, µ
26

27. Anticuerpos
Anticuerpos monoclonales.
• Cuando
inmunizamos
un
animal
con
un
antígeno
obtenemos una mezcla de anticuerpos contra los diferentes
epítopos → Anticuerpo policlonal.
-
Producción
limitada:
Necesidad
de
sucesivas
inmunizaciones.
• Anticuerpos monoclonales. Son producidos por un único
clon específico de linfocitos B, pertenecen a una clase y
subclase determinadas y tienen una especificidad única
frente a un antígeno determinado.
Anticuerpos
Marcaje superficial
λ=488 nm
Excitación
λ=530 nm
Emisión
27

28. Marcaje superficial
• La intensidad del marcaje es proporcional al número de
moléculas diana que hay en la superficie
Estudio monoparamétrico
Estudio multiparamétrico
Triples
negativos
Simples
positivos
Dobles
positivos
Triples
positivos
28

29. Representación de la
información
• Gráficas bidimensionales
S.C Bendall et al. Trens in Immunology
Representación de la
información
Gráficas tridimensionales
Gráficas n-dimensionales
29

30. Representación de la
información
• Diagrama de densidad o de
contorno.
• Diagrama de puntos
Representación de la
información
Representación de la
información
Escala lineal.
Escala logarítmica
30

31. Representación de la
información
Escala Logicle-biexponencial: Nos muestra los valores
negativos: Los software realizan una corrección del ruido de
fondo (baseline) que puede hacer que ciertas partículas muy
poco fluorescentes nos den un valor negativo
Representación de la
información
Escala Logicle-biexponencial
Estrategia de análisis
31

32. Estrategia de análisis
CD28
CD 95
Fluorocromos
en
Tándem.
Falsos
positivos
HY Maecker Cytometry Part A 62A:169–173 (2004)
32

33. • El marcaje pude ser superficial o intracelular.
• En el caso del marcaje intracelular hay que.
- Permeabilizar la célula. Los anticuerpos no difunden
a través de la membrana celular → Detergentes
(Saponina, Tween).
- Fijar la célula para evitar que el contenido intracelular
salga al exterior → paraformaldehido, etanol.
• Comprobar que el tratamiento no afecte al marcaje.
Marcaje intracelular
Marcaje
superficial
Fijación
Permeabilización
Marcaje
intracelular
Estrategias de marcado
Directo
Indirecto
Avidina-Biotina
Primario conjugado
(directo)
Primario conjugado
con biotina
Primario sin conjugar
(indirecto)
Complejo avidina-fluorocromo
Secundario conjugado
(indirecto)
33

34. • Para realizar el marcaje simplemente se añade el anticuerpo
a la suspensión celular, se deja incubar 15-30 min. A 4º C, se
lava para eliminar el exceso de anticuerpo, se resuspende y
se lleva al citómetro
• En el caso de marcaje indirecto se hacen 2 incubaciones
consecutivas con un paso de lavado intermedio.
• Si trabajamos directamente con sangre debemos realizar un
paso final de lisis de eritrocitos sin afectar a los leucocitos.
• Si no podemos analizarlas en el momento se puede fijar las
células
Controles de isotipo.
• El anticuerpo puede unirse inespecíficamente a la
superficie celular o a las proteínas citoplasmáticas →
Falso positivo.
• Para controlar este problema se usan los controles de
isotipo: Anticuerpos de la misma clase del que usamos y
con el mismo fluorocromo pero diseñados para reconocer
moléculas que nunca están presentes en las células → el
marcaje
que
aparezca
sólo
será
por
uniones
inespecíficas.
Controles de isotipo
Unión específica
Unión inespecífica
Control de isotipo
Primario conjugado
(directo)
Control de isotipo
34

35. Representación de la
información: Controles de isotipo
CONTROLES BIOLÓGICOS
• Para que los controles de isotipo sean adecuados es
necesario que se comporten igual que los anticuerpos que
vamos a usar → Difícil de asegurar (¿concentración?
¿moléculas de fluorocromo por anticuerpo?)
• El mejor control es usar nuestro anticuerpo en unas células lo
mas parecidas posibles a las que queremos estudiar pero que
no expresen el marcador de interés → Control biológico.
CONTROLES BIOLÓGICOS
CD8
35

36. Controles FMO
• No corrigen la unión inespecífica sino la interferencia entre
fluorocromos que no elimina la compensación
•Se añaden en un tubo todos los fluorocromos menos el
“controlado” → Fluorescence Minus One
Perfetto et al. Nature Review Immunology (4) 648-655, 2004
Controles
Comparación
de controles
H.T MAECKER BD Biosciences
Bloqueo de receptores Fc
• Diversos tipos de leucocitos poseen receptores que se unen a
la zona constante de los anticuerpos.
• Unen por lo tanto inespecíficamente cualquier anticuerpo que
se les añada
Receptor Fc
Antígeno
Anticuerpo
conjugado
36

37. Bloqueo de receptores Fc
• Para solucionar este problema, antes de añadir el
anticuerpo específico, se incuba la suspensión celular con
un gran exceso de anticuerpo sin marcar
• Especialmente importante si la señal fluorescente es
débil, en el caso de marcajes intensos aunque disminuye la
relación señal/ruido no es imprescindible
Bloqueo de receptores Fc
IgG (ratón)
Antígeno
Receptor Fc
Anticuerpo
conjugado
ASPECTOS PRÁCTICOS
¿Cuánto anticuerpo añado?
• Si añadimos más anticuerpo tenemos más unión a la
proteína problema, pero también más unión inespecífica.
Señal/ ruido
Titulación
del
anticuerpo:
Probar diferentes cantidades
hasta encontrar la que da la
relación señal/ruido óptima
Concentración de anticuerpo
37

38. ASPECTOS PRÁCTICOS
¿Cuánto anticuerpo añado?
• Lavar después de añadir el anticuerpo disminuye mucho la
unión inespecífica
Unión específica
Señal
Unión inespecífica.
Concentración de anticuerpo
CITOMETRÍA DE FLUJO.
ESTUDIO DE CICLO CELULAR Y
PROLIFERACIÓN
• Estudio de ácidos nucleicos.
- Fluorocromos usados.
- Aplicaciones:
+ Detección de células nucleadas.
+ Discriminación de células muertas.
+ Estudio de ciclo celular. Fundamento, adquisición y
eliminación de dobletes.
- Ciclo celular y BrdU
- Ciclo celular e inmunofenotipado.
• Estudios de proliferación. Número de divisiones celulares
38

39. • Se usan fluorocromos con las siguientes características.
- Unión estequiométrica a los ácidos nucleicos.
- Fijación estable a los mismos.
- La fluorescencia aumenta al unirse.
• Diversas especificidades: Unión a ADN y ARN, pares A-T,
pares G-C.
• 2 tipos.
- Impermeables. No atraviesan la membrana plasmática
intacta.
- Permeables. Atraviesan la membrana plasmática.
Detección de células
nucleadas
• Incubamos con una sonda permeable de unión al ADN.
Entra en todas las células y tiñe aquellas que tienen
núcleo
• Interesante si trabajamos en
sangre
con
poblaciones
minoritarias: Elimina hematíes
y agregados plaquetarios
Stuart T.F et al Blood 2006
39

40. Viabilidad celular.
• Cuando la célula muere se abren poros en la membrana lo
que permite la entrada de colorantes que se unen al ADN
incapaces de atravesar la membrana intacta
Importante
eliminar
del
análisis las células muertas
→ Más autofluorescentes y
más unión inespecífica del
anticuerpo.
Viabilidad celular.
Vivas/muertas
Marcaje inespecífico
Ciclo Celular
Ciclo
celular
y
contenido de ADN.
G0/G1 → 2n.
S
→ 2n/4n.
G2/M → 4n
40

41. Ciclo Celular
• La cantidad de fluorescencia emitida es proporcional a la
cantidad de ADN.
• El colorante más usado es el yoduro de propidio.
• El PI tiene una elevada eficiencia cuántica y es barato, pero
se une también a RNA bicatenario (hay que tratar con RNAsa)
y tiene un espectro de emisión ancho (dificulta la posibilidad
de otros marcajes).
Ciclo Celular
PI
Fijación
Permeabilización
G0/G1
S
G2/M
Ciclo Celular.
Adquisición en el citómetro.
• Siempre en escala lineal: Mayor separación de los picos.
• Muy importante conseguir la mayor resolución de los picos
(bajo CV).
- Adquirir a la menor presión y velocidad de inyección
posibles.
- Adquirir el máximo número de células posible (> 10.000)
41

42. Ciclo Celular
Discriminación
de dobletes.
120
Tiempo
Láser
90
2n
2n+2n
60
30
0
PI Area
Yellow-A
4n
Igual área pero
diferente anchura del pulso.
Contenido de DNA
R1
0
30
60
90
120
Yellow-W
PI Anchura
Ciclo Celular
Discriminación de dobletes
Ciclo Celular
CARIOTIPO DE
FLUJO
42

43. Ciclo Celular
• No
G0/G1
es
posible
la
delimitación exacta de
las fases del ciclo
G2/M
S
G0/G
1
S
G2/M
Ciclo Celular
• Se
puede
recurrir
a
280
G0/G1
programas
Number
210
que
informáticos
utilizan
modelos
matemáticos para delimitar
70
140
G2/M
las fases
0
S
0
30
60
90
120
150
Channels (Yellow-A)
Ciclo Celular
celulares
con
diferente
400
800
1200
contenido de ADN
0
Number
1600
• Mezcla de 2 poblaciones
0
30
60
90
120
150
Channels (Yellow-A)
43

44. Ciclo Celular
0
200
400
Number
600
800
• Mezcla de poblaciones 2n y 4n
0
50
100
150
200
250
Channels (Yellow-A)
Ciclo Celular
• Controles en ciclo celular.
Timocitos de ternera
Eritrocitos de pollo 35% del
ADN humano
Ciclo Celular. BrdU
• La BromodeoxiUridina es un análogo de la Timidina. Se
incorpora al ADN de aquellas células que están duplicando el
ADN.
• Añadiendo posteriormente un anticuerpo anti BrdU y un
fluorocromo que se una al ADN podemos determinar que
células están en la fase S del ciclo.
• Problema. Para que el anticuerpo llegue hasta la BrdU es
necesario desnaturalizar el ADN (Calor, DNAsas, ácidos).
Existen otros análogos de la T que no requieren este paso.
44

45. Ciclo Celular. BrdU
Incubación
Br
BrdU (5-bromo-2'-deoxyuridine)
Desnaturalización
Br
Ciclo Celular. EdU
Incubación
EdU (5-ethynyl-2'-deoxyuridine)
Ciclo Celular. BrdU
Ormerod M. Basic flow cytometry
45

46. Ciclo Celular. BrdU
• Si
añadimos
cultivo,
lavamos
recogiendo
BrdU
al
incubamos,
y
vamos
células
a
diversos intervalos tenemos
una imagen dinámica del
ciclo
Gary Warnes. University of London
Ciclo Celular
• No se puede distinguir la fase G0 de la G1 (ambas 2n) y la
fase G2 de la M (ambas 4n)
• Si medimos el contenido en ARN podemos separa G0 de
G1
• Mediante inmunofenotipado de proteínas cuya expresión
cambia durante las fases del ciclo podemos discriminar G0
de G1 y G2 de M
Ciclo Celular.
Contenido de ARN
Pyronina. Intercalante en dsNA.
- Más especificidad por dsRNA, aunque no exclusivo.
- Marca rRNA y tRNA no RNA total.
- Exc 547-560nm, emi 565-574nm.
Naranga de acridinio.
- Mide el RNA total.
- Se excita a 488nm y emite en rojo unido al RNA y verde
unido al DNA
- Muy dependiente de las condiciones: concentración,
fuerza iónica, detergentes.
46

47. Ciclo Celular.
Contenido de ARN
WOODWARD et al. PNAS 2007
Ciclo Celular.
Inmunofenotipado
• Diferenciación de fase G2- M
Ormerod M. Basic flow cytometry
Ciclo Celular.
Inmunofenotipado
Expresión de ciclinas y ciclo celular
Ormerod M. Basic flow cytometry.
47

48. Estudio del número de
divisiones celulares
• Se usa una sonda que difunde a través de la membrana y
una vez en el interior de la célula se modifica, se vuelve
fluorescente y no pueda salir.
CFSE
Tras una
división
Tras dos divisiones
Sin dividir
Fluorescencia / célula
X
X/2
X/4
Estudio del número de
divisiones celulares
Proliferantes
No proliferantes
• El número de ciclos distinguibles es limitado: Dilución
excesiva de la sonda.
• La fluorescencia depende del tamaño, poblaciones con
mucha dispersión del mismo dan resultados pobres.
Estudio del número de
divisiones celulares
• Combinación con marcaje
de membrana
• Combinación con estudio
de viabilidad
48

49. CITOMETRÍA DE FLUJO.
ESTUDIO APOPTOSIS Y MUERTE
CELULAR
Apoptosis
• La apoptosis es un modo de muerte celular
activo y
fisiológico en el que la célula ejecuta el programa de su
propia muerte. Regulado por Caspasas
• La necrosis es una muerte accidental debida a un estrés:
choque térmico, hipotónico, pH..
• Los métodos deben distinguirlas
Apoptosis
49

50. Apoptosis
Apoptosis
Diferencias entre
apoptosis y necrosis
Apoptosis
Necrosis
Núcleo
Condensación densa
de la cromatina
Agrupación irregular de
la cromatina
Organelas
citoplásmicas
Intactas
morfológicamente
Anormales
Membrana celular
Cuerpos apoptóticos
Blebbing
Blebbing y pérdida de la
integridad
Volumen celular
Se reduce
Se incrementa
En tejidos
Células aisladas
Grupos de células
Respuesta tisular
Ninguna
Inflamación
50

51. Apoptosis y patología.
• Disminuida:
• Aumentada:
- Cancer: Linfomas foliculares, tumores
- SIDA
-Enfermedades
neurodegenerativas:
con
mutación
en
p53,
tumores
Alzeheimer, Parkinson, ELA, Retinitis
hormonodependientes (mama, próstata,
pigmentosa
ovario)
- Anemia aplásica.
-
- Isquemia: Infarto, Accidente cerebro
Glomerulonefritis
vascular
-
- Cirrosis alcohólica
adenovirus
Enfermedades
Virus:
autoinmunes:
Herpesvirus,
LES,
poxvirus,
Apoptosis
Métodos De Análisis por
citometría
• Exposición fosfatidilserina
• Fragmentación de ADN
• Detección de caspasas activadas.
• Función mitocondrial.
• Otros: Radicales de oxígeno, cambios en la permeabilidad
de membrana, niveles de iones, Familia Bcl2, cambios en
tamaño y complejidad
Estudio de apoptosis.
Anexina V/PI
PS: Fosfatidil serina
51

52. Estudio de apoptosis.
Anexina V/PI
10 3
10 3
14%
10
10 2
2
15%
10 1
10 2
10 3
10 4
10
1
37%
10 0
10 1
5%
10 0
10
5%
10
10 4
4
Fármaco
6%
0
Yoduro de Propidio
Control
10 0
10 1
10 2
10 3
10 4
Anexina V
Células vivas
Apoptosis temprana
Apoptosis tardía
Necrosis
Estudio de apoptosis.
Anexina V/PI
• Método sencillo, rápido y relativamente barato.
• Fácil de combinar con inmunofenotipado de membrana: La
anexina se puede marcar con el fluorocromo que queramos y
el PI se puede sustituir por otra sonda similar (7-AAD).
• Limitaciones:
- Apoptosis sin exposición de PS.
- En la necrosis puede haber marcaje de Anexina V.
Estudio de apoptosis.
Anexina V/PI
NECROSIS
VIVAS
APOPTOSIS
TARDIA +
¿NECROSIS?
APOPTOSIS
TEMPRANA
52

53. Estudio de apoptosis.
Fragmentación del ADN
Rotura
internucleosomal
Estudio de apoptosis.
Fragmentación del ADN
T – Tdt mediated
U – dUTP-biotin
N – nick
E – end
L – labelling
Poli-BrdU
Tdt
3’-OH-ADN
3’-OH-ADN
3’-OH-ADN-UTP-Brd
Anti-BrdU-FITC
3’-OH-ADN
3’-OH-ADN
ADN
• Técnica relativamente sencilla.
• Implica fijar las células.
• Existen procesos apoptoticos sin rotura internucleosomal
Estudio de apoptosis.
Fragmentación del ADN
• Se puede combinar con inmunofenotipado y con estudio
del ciclo celular.
Ormerod M. Basic flow cytometry
53

54. Estudio de apoptosis.
Fragmentación del ADN
• Pico sub-diploide
3%
0.25 µg/mL
Control
Mitoxantrona
G1
S
G1
21%
S
G2/M
0
40
80
120
G2/M
160
200
0
40
80
120
160
200
Channels (FL2-A-PI MITO 24H)
Channels (FL2-A-PI CONTROL 24H)
Estudio de apoptosis.
Activación de caspasas
• El método más directo
es
usar
marcados
anticuerpos
contra
la
forma activada de las
caspasas
Estudio de apoptosis.
Activación de caspasas
• Detección de rotura de sustratos.
- Anticuerpos anti-proteínas rotas por caspasas (PARP).
- Rotura de sustratos con cambio de fluorescencia.
SUSTRATO-
SUSTRATO
+
CASPASA
• Inhibidores fluorescentes (FLICA)
54

55. Estudio de apoptosis.
Activación de caspasas
• Rotura de sustrato fluorescente
Estaurosporina
Control
Ormerod. Basic flow Cytometry
Estudio de apoptosis.
Función mitocondrial
• La mitocondria es el mediador clave en la apoptosis
inducida por estrés celular.
• Uno de los primeros cambios que ocurre al iniciarse la
apoptosis es una pérdida del potencial de membrana
mitocondrial (Ψm).
• Existen fluorocromos cuya fluorescencia varia con Ψm
Estudio de apoptosis.
Función mitocondrial
• Moléculas fluorescentes que se acumulan en la mitocondria
si Ψm está conservado, sino, salen de la mitocondria y de la
célula.
Control
KCN
DiOC6(3)
N: Vivas; D: muertas; A: apoptóticas
Ormerod. Basic flow Cytometry
55

56. Estudio de apoptosis.
Función mitocondrial
• Moléculas que cambian su fluorescencia en función de su
estado de agregación: Si Ψ2 está intacto se acumulan en la
mitocondria (alta concentración, agregados) si no salen al
citoplasma (baja concentración monómeros)
JC-1.
• Agregados: rojos.
• Monómeros: Verdes
A: Control; B: Apoptosis
Estudio de apoptosis.
Función mitocondrial
• Existen otros parámetros mitocondriales que se afectan
en la apoptosis y que podemos estudiar por citometría
• Liberación cit c.
• Producción de ROS: Disfunción de la cadena respiratorio
• Apo 2.7: Anticuerpo que reacciona con una proteína
mitocondrial que aparece en membrana en la apoptosis.
muy temprano
Estudio de apoptosis.
Proteínas de la familia Bcl2
• Familia de proteínas que controla la formación de poros en
la membrana mitocondrial y regula la apoptosis.
- Pro apoptóticas: Bax, Bak, Bid, Bik, Bcl-Xs, Bad
- Anti apoptóticas : Bcl2, Bcl-XL, Bcl-w, Mcl-1, Brag-1, Bfl-1
Ratio Bcl2/Bax
Neutralidad
Supervivencia
Muerte
56

57. Cambios en el volumen y
la complejidad celular
APOPTOSIS
VOLUMEN
COMPLEJIDAD
inicial
Disminución
Aumento
tardía
Disminución
Disminución
inicial
Aumento
Disminución
tardía
Disminución
Disminución
NECROSIS
Poco específico y poco sensible: células muertas, debris,
núcleos aislados, cuerpos apoptóticos
Cambios en volumen y
complejidad celular
Fármaco
128
128
0
0
64
64
SSC
192
192
256
256
Control
0
64
128
192
256
0
64
128
192
256
FSC
Cambios en la
permeabilidad de la
membrana
• A medida que aumenta la
apoptosis
siendo
la
membrana
va
mas
permeable
a
fluorocromos con carga como
PI, aunque no pierde totalmente
su funcionalidad.
Ormerod. Basic flow Cytometry
• La cantidad de fluorocromo que entra es demasiado
pequeña para dar el máximo de fluorescencia posible
57

58. Estudio de apoptosis.
Secuencia de acontecimientos.
Formación apoptosoma
Disminución ∆ψm
Activación caspasa
Proteólisis PARP
Externalización FS
Fragmentación ADN
Cambios morfológicos
Membrana permeable
2
4
6
8
10
Horas aproximadas después de la inducción por anti-FAS
CITOMETRÍA DE FLUJO.
ANÁLISIS FUNCIONAL.
• Producción de ROS.
• Medida de pH
• Medida de concentración intracelular de Ca2+ libre
• Potencial de membrana
• Actividad enzimática.
• Estudio de genes reporteros: Proteínas fluorescentes.
• Estudio de la “side population”.
• Estudio de componentes celulares.
• Otras aplicaciones.
58

59. Estudios funcionales
APLICACIONES
• Se acopla un cambio de emisión a un proceso biológico:
Moléculas cuya fluorescencia cambia con pH, nivel de iones,
procesamiento por una enzima, potencial de membrana celular
o mitocondrial ….. y que se retiene en la célula.
Producción de especies
reactivas de oxígeno
• Fluorocromos cuya
Dihidrorodamina 123
fluorescencia cambia
con su estado redox
H2O2
RODAMINA 123
Producción de especies
reactivas de oxígeno
• Estallido respiratorio en
neutrófilos estudiado con
dihidroetidina
Ormerod M. Basic Flow Cytometry
59

60. Structure
Reactive Oxygen Species
H2O2
Hydrogen peroxide
Carboxy-H2DCFDA
,CM-H2DCFDA
,Dihydrocalcein
AM
Dihydrorhodamine 123 , Dihydrorhodamine 6G , H2DCFDA ,
Lucigenin Luminol , RedoxSensor Red CC-1
HO•
Hydroxyl radical
3'-(p-Aminophenyl)
fluorescein
(APF),
3'-(p-Hydroxyphenyl)
fluorescein (HPF), CM-H2DCFDA Proxyl fluorescamine ,TEMPO-9AC
HOCl
Hypochlorous acid
Aminophenyl fluorescein (APF) , Dihydrorhodamine 123 ,Luminol
NO
Nitric oxide
DAF-FM , DAF-FM diacetate, DAA , 2,3-Diaminonaphthalene ,Luminol
ROO•
Peroxyl radical, including both
alkylperoxyl and hydroperoxyl
radicals (wherein R = H)
BODIPY FL EDA, BODIPY 665/676, H2DCFDA, Carboxy-H2DCFDA,
CM-H2DCFDA, DPPP, Luminol, cis-Parinaric acid, RedoxSensor Red
CC-1
ONOO–
Peroxynitrite anion
3'-(p-Aminophenyl)
fluorescein
(APF),
3'-(p-Hydroxyphenyl)
fluorescein (HPF), H2DCFDA, Carboxy-H2DCFDA, CM-H2DCFDA,
Coelenterazine Dihydrorhodamine 123, Dihydrorhodamine 6G,
Luminol
1O
2
Singlet oxygen
Singlet
Oxygen
methoxyvinyl)pyrene
Superoxide anion
Coelenterazine, Dihydroethidium, Fc OxyBURST Green assay
reagent OxyBURST Green H2DCFDA SE, OxyBURST Green H2HFF
BSA, Lucigenin Luminol, MCLA, MTT, NBT, RedoxSensor Red CC-1,
TEMPO-9-AC, XTT
•O2–
Detection Reagents
Sensor
Green
reagent,
trans-1-(2'-
Medida del pH
• Generalmente ácidos débiles con un pKa cercano a 7 y
con
un
fluorescencia
diferente
en
las
formas
desprotonadas y protonadas.
Cambio en la intensidad de
fluorescencia de la fluoresceina
con el pH
Medida del pH
• Generalmente
fluorocromos
se
con
usan
distintos
picos de emisión entre la forma
protonada y desprotonada →
Medidas ratiométricas
Espectro de emisión de
SNARF-1 en función del pH
60

61. Medida del pH
• Medidas cinéticas de cambio de pH intracelular en leucocitos
tras acidificación del medio con BCEF (ratio amarillo/verde)
O´Connor JE et al. IUBMIB Life. 2001
Medida del pH
• Método cuantitativo → Crear
curvas de calibración
Medida del pH
6.5 7 7.5
MUESTRA
61

62. Concentración de Ca2+
libre intracelular
• Moléculas cuya fluorescencia varía con los niveles de Ca2+
intracelular
Cambio en la
Cambio en la
λ de emisión
intensidad
Espectros de emisión fluo-3 y
fura red en función de la
concentración de Ca2+
Espectro de emisión Indo-1 en
función de la concentración de
Ca2+
Concentración de Ca2+
libre intracelular
Medidas
directas
Cambios
en
la
concentración de Ca2+
intracelular en linfocitos,
monocitos y macrófagos
medidos con Fluo 3
Concentración de Ca2+
libre intracelular
Medidas
ratiométricas
Medida de Ca2+ intracelular en células
JurkatJ6 después de añadir un anticuerpo
anti-CD3 con una mezcla de Fluo3 y Fura Red
(ratio 525/675)
62

63. Medida del potencial de
membrana
Medida del potencial de
membrana
Polarizada
Despolarizada
Despolarización de Staphylococcus
aureus inducida por CCCP medida
con DiOC2(3).
Medida de la actividad
enzimática
• Se añade un sustrato que difunde en la célula y al ser
procesado por la enzima se vuelve fluorescente (sustrato
fluorogénico).
• Podemos medir la actividad de proteasas (caspasas),
esterasas (CFSE), oxidasas, dehidrogenasas, transferasas,
fosforilasas…….
63

64. Estudio de laDE ALDOLASA
ACTIVIDAD actividad de
aldolasa
Con actividad enzimática
Sin actividad enzimática
Genes reporteros,
proteínas fluorescentes
A
Control sin transfectar
Células transfectadas con GFP
Chudakov D M et al.
Physiol Rev 2010;90:11031163
©2010 by American Physiological Society
64

65. Estudio de la “side
population”
• Las
células
progenitoras
presenta
gran
actividad
de
transportadores de la familia ABC que expulsan fuera de la célula
el Hoechst 33342
Estudio de la “side
population”
Bone Marrow
Estudio de la “side
population”
• Se excita con laser UV y se mide emisión a 420 y 670 nm
A
B
Hoechst Blue
+ verapamil
Hoechst Far Red
65

66. Detección de
componentes celulares
• Marcaje con rojo nilo y Syto
62
para
estudiar
células
nucleadas con depósitos de
lípidos neutros
Otras aplicaciones
O´Connor JE et al. IUBMIB Life. 2001
CITOMETRÍA DE FLUJO.
SEPARACIÓN CELULAR.
66

67. Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS)
• Separación individualizada de células en función de
parámetros definidos por citometría de flujo.
• Posteriores estudios de biología molecular (RT-PCR,
FISH),
clonación
de
líneas
celulares,
estudios
funcionales, etc.
Sorting Electroestático
ooooo
ooooo
oooo
ooo
o
o
Drop delay o
o +
o o
o +
o +
oo+
o
o+
+
Transductor Vibra a una frecuencia
determinada para producir separación del
chorro en gotas.
Punto de incidencia del láser y de decisión
Carga de la gota
+ Azul - rojo.
-
Gotas cargadas son separadas en un
campo electroestático ± 3000 V
oo
o
oooo oooo oooo
Izq basura der
Recogida
Nozzle
67

68. • Se generan hasta
100.000 cels/seg.
• Lo ideal es que
haya un máximo de
1 célula cada 3
gotas
Gota satélite
Amplitud
Frecuencia
Separación de dos poblaciones celulares
Separación de dos poblaciones celulares
68

69. Separación de dos poblaciones celulares
Separación de cuatro poblaciones celulares
Separación de cuatro poblaciones celulares
69

70. • Se pueden separar células individuales directamente en
placas de 96 pocillos.
• Se puede separar directamente en placas de 6, 12, 24
pocillos o en un porta de microscopia.
• Se puede mantener la muestra a
4 o 37º C.
• Se puede recoger la muestra a 4
o 37º C.
• El parámetro crítico es el drop delay: Tiempo que transcurre
desde que seleccionamos la célula hasta que se carga la gota
que la contiene.
• Depende
de
cómo
se
forman las gotas → Ajustar
cada vez que hacemos una
separación.
• Separación
de
esferas
fluorescentes sobre un porta
• Accudrop. Sistema automatizado basado en esferas
fluorescentes. Un láser en la parte inferior del sorter nos
permite ver donde están.
70

71. • Recuperación-eficiencia: % de partículas sorteadas
recogidas del total de partículas que nos interesan.
• Pureza: % de partículas sorteadas recogidas que
cumplen los criterios seleccionados en función del total
sorteado.
•
Si
aumentamos
la
pureza
disminuimos
la
recuperación y viceversa
rendimiento
pureza
¿ Y esto cuanto tarda?
Velocidad lectura
2.000 cels/sg
Nº deseado
de células
1.000
10.000
100.000
1.000.000
10.000.000
100.000.000
Concentración de células en la muestra
0,1%
8 min
1,4 h
14 h
5,8 d
1,9 m
1,6 a
1,0%
48 sg
8 min
1,4 h
14 h
5,8 d
1,9 m
5,0% 50,0%
10 sg
1 sg
1,7 min 10 sg
17 min 1,7 min
2,8 h 17 min
1,2 d
2,8 h
12 d
1,2 d
71

72. • Sistemas de cámara abierta → RIESGO BIOLÓGICO.
• Sistemas Caros. Tanto equipamiento como consumibles.
• Sistemas
lentos.
Pureza
depende
de
cuantas
células/segundo analicemos y la resolución de la citometría
es mejor si el número de células por segundo es bajo.
• Viabilidad celular variable: Tipo celular, tiempo y presión
de sorting, medio de recogida.
Sorters hidraúlicos
Emplean jeringas, energía acústica, etc.. para desviar el flujo
líquido durante algunos milisegundos y con él la célula
seleccionada.
Cámara cerrada: no contaminación
Poco complicados, baratos y adaptables
Sistemas sin necesidad ajuste
Facilidad de uso (similar a analizador)
Baja velocidad de separación
Baja viabilidad del producto
Baja concentración celular
Sorters hidraúlicos
72

73. Sorting de partículas
grandes. BIOSORT
MACS
• Magnetic
activated
cell
sorting.
Utiliza
partículas
magnéticas unidas a anticuerpos
Nanopartículas
unidas a la célula
MACS
Anticuerpo unido a
nanopartícula magnética
ELECTROIMÁN
N
S
MATRIZ
FERROMAGNÉTICA
73

74. FACS vs MACS:
Uno o los dos?
FACS
MACS
Separación
multiparamétrica
Separación por un solo
parámetro
No permiten
separaciones masivas
Separan un número elevado
de células.
Equipos caros, pero
amortizables a medio
plazo
Muy caros
Indicado para separar
poblaciones poco
frecuentes
Rápidos
Son dos sistemas compatibles
CITOMETRÍA DE FLUJO.
ANÁLISIS MULTIPLEX.
• Estudio de moléculas solubles por citometría de flujo.
• El límite de detección en citometría de flujo es de 0.5 µ,
para poder estudiarlas necesitamos retenerlas en esferas
fluorescentes que se pueden detectar por el citómetro.
• La citometría nos permite estudiar diversas moléculas
simultáneamente asociando cada una a una esfera
diferente que puede distinguirse por citometría.
74

75. • Método realizable en cualquier citómetro aunque existen
equipos
especialmente
diseñados
para
el
análisis
multiplex.
Diferenciación de las
esferas
• Mezcla de beads de diferentes tamaños y con diferente
concentración de un fluorocromo que se excita con un láser rojo.
Diferenciación de las
esferas
• Esferas del mismo tamaño
(5,6-6,5 µ) con una diferente
mezcla
de
2
colorantes
excitados por el láser rojo
75

76. Diferenciación de las
esferas
Color 1
Matriz de
microesferas
coloreadas
Color 2
Diferenciación de las
esferas
Discriminador de dobletes
Elimina por tamaño
restos y agregados de
esferas
76

77. Diferenciación de las
esferas
• Esferas del mismo tamaño con una
diferente
mezcla
de
3
colorantes
excitados por el láser rojo → Genera
500 esferas diferentes
• Las esferas se funcionalizan con diferentes moléculas
en función de lo que queramos estudiar
análisis de concentración
de proteínas solubles
Multiplex
ELISA
IL-2
IL-
IL-5
IL-
IL-4
IL-
IFN-g
IFN-
IL-10
ILPE
PE
PE
PE
TNFTNF-alfa
PE
PE
77

78. análisis de concentración
de proteínas solubles
The immune-complex/
microsphere is then excited by
The another high analyte
Free excess streptavidin-PE
In assays withwash step
Afterphycoerythrin is excited
The
A primaryexcessisis specific
The the ******antibodyand bead
biotinylated,laser. a binds
primary
Microsphere biotinylated
by the reporter analyte
binds to antibodyadded to
numbersthe PElaser
Streptavidin non-specifically
specific emmission
specificpolystyrene bindis quantified
to thespecific is antibody is
forthe aanalyte analytewhich
5.6mMbiotinylated reporter
emits antibodies beadto
bound reporter
reporter fluorescence – no
the assay. The biotinylated
added the toassay after
crossreactivitythe bead
conjugatedluminex other
with by tofluorescentand the bead
two the with dyes
is quantified in nonantibody leadinga binds to
the Strep-PEby the a signal
reporter antibodyto Luminex
identified.
another manner.
analytesby an step.
surfacethe fouramine
incorporated into it in
reader.
amplification.
specific occurs.
one of wash available
coupling reaction
different ratios.
sites.
tomado de UPSTATE.
Serological corporation
análisis de concentración
de proteínas solubles
Laser
A
Laser
B
análisis de concentración
de proteínas solubles
Una vez clasificada la esfera con el primer láser, el segundo
mide la fluorescencia del fluorocromo asociado al segundo
anticuerpo que es proporcional a la cantidad de proteína en la
muestra
Color analizador
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
Norte
Oeste
1er trim .
2do trim .
3er trim .
4to trim .
Este
Color clasificador 1
78

79. análisis de concentración
de proteínas solubles
• Generando una curva de calibración podemos cuantificar la
concentración
Curva de calibración
Se
genera
una
curva
de
calibración
asociando
la
fluorescencia medida a unas concentraciones de analito
conocidas
0 pg/ml
312.5 pg/ml
40 pg/ml
625 pg/ml
156 pg/ml
5000 pg/ml
Curva de calibración
79

80. Por último los valores de fluorescencia obtenidos para cada
muestra se interpolan en la curva de calibración y se
calcula la concentración
Control negativo
Muestra
• Permite determinar hasta 500 proteínas en un solo ensayo.
• Gran ahorro:
- Económico: Equipamiento más caro que un ELISA pero se
compensa con el menor coste de los reactivos
- Tiempo
- Muestra: Con sólo 25 µl podemos determinar las 500
proteínas.
80

81. Aplicaciones en biología
molecular
• En lugar de anticuerpo funcionalizamos las esferas con
sondas de ácidos nucleicos.
• Se puede aplicar a múltiples aplicaciones: Genotipado
(estudios de SNPs), expresión génica, concentración de
micro RNAs, reordenamientos génicos.
• Funcionalizando con sondas de ácidos nucleicos también
podemos estudiar expresión de factores de trascripción
81

82. Genotipado
Genotipado
Genotipado
82

83. Genotipado
Comparación de métodos
MULTIPLEX
Ding C, Jin S. Methods Mol Biol. 2009
Cuantificación de
microRNAs
• No necesita amplificación por PCR
Cuantificación de
microRNAs
83

84. Expresión génica
• No
es
necesario
convertirlo en cDNA.
Grandes
reordenamientos
Factores de
Trascripción
84

85. Factores de
Trascripción
• Sistema no basado en citometría de flujo.
• Requiere el uso de beads magnéticas.
• Equipo mas barato que los citómetros pero menos sensible
• Las partículas magnéticas
se retienen sobre un imán y
se iluminan con 2 LEDs:
Rojo y verde.
• La fluorescencia se lee con
una cámara CCD.
85

86. 86