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I Jornadas Científicas IIS Aragón
               8-9 Noviembre 2010




UTILIZACIÓN DE LAS MSCs EN EL TRATAMIENTO DE
LESIONES DEL APARATO LOCOMOTOR EN CABALLOS




                                   Clementina Rodellar Penella
¿Qué son las MSCs?
                                               MÉDULA (BM-MSCs)
Mesenchymal Stem cells (MSCs)
                                               TEJIDO ADIPOSO (AT-MSCs)


    Células multipotentes aisladas por Friedestein y cols en 1970


    Han pasado 40 años …

    • Controversia sobre su nomenclatura: CFUs, MSCs, MPCs
    • Problemas para su identificación: definición de estándares por
    la ISCT (2006):

 a) Capacidad de adherencia al plástico y capacidad para formar colonias
 b) Ausencia de determinados marcadores de superficie (CD34, CD45,
    CD14…) y presencia de otros como CD90 o CD105
 c) Capacidad de diferenciación a osteocito, condrocito y adipocito.
¿POR QUÉ MSCs?

                       - Fácil aislamiento
                       - Fácil cultivo
  CARACTERÍSTICAS
                       - Gran potencial de expansión “ex vivo”
                       - Gran potencial diferenciación


     ADEMÁS…

- Tienen capacidad inmunomoduladora y antiinflamatoria tanto “in
vivo” como “in vitro”.

- No expresan el Complejo Mayor de Histocompatibilidad de tipo II
en las especies en las que se ha estudiado como la rata, perro,
cerdo, humana y babuinos, lo que determina su baja inmunogenicidad.
¿POR QUÉ EL CABALLO?

En los países desarrollados el mundo del caballo mueve una economía
muy importante, no comparable a ningún otro animal doméstico.


   GRAN INCIDENCIA DE PATOLOGÍAS EN
TENDONES , LIGAMENTOS Y ARTICULACIONES
                                                      Retirada de la competición




                       Tiene importancia en sí mismo y como modelo
                       para patologías del aparato locomotor en humana

          - Similitudes entre tamaño y tipo de lesiones
            - Susceptible de ser entrenado y realizar desafíos atléticos

 Se considera que los resultados en caballos para este tipo de patologías podrían ser
 más fácilmente extrapolables a la situación de los deportistas humanos que los
 obtenidos con otros modelos experimentales (rata, conejo, pequeños rumiantes).
Financiación PAMER 2010




1.Caracterización de MSCs:
  - Proliferación
  - Diferenciación
  - Inmunofenotipo



2. Efectividad “in vivo” del transplante de MSCs
  autólogas en el tratamiento de lesiones del aparato
  locomotor en caballos
Financiación PAMER 2010




1.Caracterización de MSCs:
  - Proliferación
  - Diferenciación
  - Inmunofenotipo
  - Papel antiproliferativo e inmunomodulador “in vitro”
EXPRESIÓN RELATIVA DE mRNA DE ANTÍGENOS DE SUPERFICIE




                                             AT-MSC
                                             BM-MSC




* p<0,05, n= 5.
ESTUDIOS DE PROLIFERACIÓN




- > Proliferación en las MSCs obtenidas de tejido adiposo
- Grandes diferencias individuales
DIFERENCIACIÓN A OSTEOCITO, ADIPOCITO Y CONDROCITO




                                         Prolongaciones citoplasmáticas
                                         que les permiten establecer
                                         contacto con otras células




        El aspecto del nucleolo indica
        una alta actividad de síntesis
        en los ribosomas
EXPRESIÓN RELATIVA mRNA EN MARCADORES ESPECÍFICOS

OSTEOGÉNESIS

                            ADIPOGÉNESIS          BM-MSCs




                              Expresión en todos los casos entre
                              controles y células diferenciadas
                              excepto COL1A1




                  p<0,05 ** p<0,01 *** p<0,001, n= 5.
Financiación PAMER 2010




1.Caracterización de MSCs:
  - Proliferación
  - Diferenciación
  - Inmunofenotipo


2. Efectividad “in vivo” del transplante de MSCs
  autólogas y heterólogas en el tratamiento de lesiones
  del aparato locomotor en caballos
Financiación PAMER 2010




2. Efectividad “in vivo” del transplante de MSCs
  autólogas y heterólogas en el tratamiento de lesiones
  del aparato locomotor en caballos
ENSAYO I: MSCs EN TRATAMIENTO DE LESIONES NATURALES
Implante autólogo de MSCs en pacientes con tendinitis del hospital veterinario


 Tendones flexores digitales (superficial y profundo) y del
                        Caso clínico
USO CLÍNICO DE MSCs EN LESIONES NATURALES
 ligamento suspensor del menudillo
Ninguno de los caballos tratados con implante autólogo de MSC han
ENSAYO II: MSCs EN TRATAMIENTO DE LESIONES INDUCIDAS
           Lesión: Ligamento suspensor del menudillo en extremidad
mostrado reacciones adversas serias, sistémicas o locales, tras el
                   posterior (Corte sagital)
tratamiento
  Implante autólogo de MSCs en caballos de experimentación

La evolución ecográfica muestra una marcada mejoría de las lesiones,
en comparación con la evolución esperada en lesiones similares tratadas
convencionalmente
ENSAYO III: MSCs HETEROLOGAS EN ARTICULACION
La mayoría de los casos muestran una reparación ecográfica
prácticamente completa a partir de los 6 meses del tratamiento
(ecogenicidad y orientación fibrilar)

  Pre-inyección       1 mes post-        3 meses post-      8 meses post-
                      tratamiento         tratamiento        tratamiento
ENSAYO II: MSCs EN TRATAMIENTO DE LESIONES INDUCIDAS
 Implante autólogo de MSCs en caballos de experimentación
               …


    … en el tratamiento de lesiones naturales hemos
    visto que la evolución es buena, pero con lesiones
        inducidas en animales de experimentación :

 MATERIAL ANIMAL UNIFORME (sexo, peso…)
 MATERIAL ANIMAL UNIFORME (sexo, peso…)

 LESIONES BILATERALES SIMILARES
 CONTROLES
 FACTORES DE CRECIMIENTO ó MSCs?
 ANÁLISIS POST-MORTEN
ENSAYO II: MSCs EN TRATAMIENTO DE LESIONES INDUCIDAS
 Implante autólogo de MSCs en caballos de experimentación con tendinitis
 inducidas
  24 lesiones inducidas mecánicamente en caballos
  de experimentación (12 animales).
                            12 CABALLOS
    Lote A: 6
            tratado        sólo con fPRP      6
    Lote B: tratado        con FT-MSCs y resuspendidas en RL
      3
    Lote C: tratado        3             3           3
                           con BM-MSCs y resuspendidas en RL
    Lote D: tratado
 IZDA   DRCHA IZDA         sólo con RL
                             DRCHA IZDA DRCHA IZDA DRCHA
 BM       PRPs     BM          RL        FT     PRPs       FT        RL
 (B)       (A)     (B)        (D)        (C)     (A)       (C)      (D)


  Valoración clínica y ecográfica.
  Caracterización genética, bioquímica, histológica,
  mecánica y funcional del tejido regenerado.
FACULTAD DE VETERINARIA

Inmaculada Martín
Rosario Osta
Pilar Zaragoza
Paco Vázquez
Antonio Romero
Beatriz Ranera
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Jaber Lyahyai
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UTILIZACIÓN DE MSCs EN LESIONES LOCOMOTORAS EQUINAS

  • 1. I Jornadas Científicas IIS Aragón 8-9 Noviembre 2010 UTILIZACIÓN DE LAS MSCs EN EL TRATAMIENTO DE LESIONES DEL APARATO LOCOMOTOR EN CABALLOS Clementina Rodellar Penella
  • 2. ¿Qué son las MSCs? MÉDULA (BM-MSCs) Mesenchymal Stem cells (MSCs) TEJIDO ADIPOSO (AT-MSCs) Células multipotentes aisladas por Friedestein y cols en 1970 Han pasado 40 años … • Controversia sobre su nomenclatura: CFUs, MSCs, MPCs • Problemas para su identificación: definición de estándares por la ISCT (2006): a) Capacidad de adherencia al plástico y capacidad para formar colonias b) Ausencia de determinados marcadores de superficie (CD34, CD45, CD14…) y presencia de otros como CD90 o CD105 c) Capacidad de diferenciación a osteocito, condrocito y adipocito.
  • 3. ¿POR QUÉ MSCs? - Fácil aislamiento - Fácil cultivo CARACTERÍSTICAS - Gran potencial de expansión “ex vivo” - Gran potencial diferenciación ADEMÁS… - Tienen capacidad inmunomoduladora y antiinflamatoria tanto “in vivo” como “in vitro”. - No expresan el Complejo Mayor de Histocompatibilidad de tipo II en las especies en las que se ha estudiado como la rata, perro, cerdo, humana y babuinos, lo que determina su baja inmunogenicidad.
  • 4. ¿POR QUÉ EL CABALLO? En los países desarrollados el mundo del caballo mueve una economía muy importante, no comparable a ningún otro animal doméstico. GRAN INCIDENCIA DE PATOLOGÍAS EN TENDONES , LIGAMENTOS Y ARTICULACIONES Retirada de la competición Tiene importancia en sí mismo y como modelo para patologías del aparato locomotor en humana - Similitudes entre tamaño y tipo de lesiones - Susceptible de ser entrenado y realizar desafíos atléticos Se considera que los resultados en caballos para este tipo de patologías podrían ser más fácilmente extrapolables a la situación de los deportistas humanos que los obtenidos con otros modelos experimentales (rata, conejo, pequeños rumiantes).
  • 5. Financiación PAMER 2010 1.Caracterización de MSCs: - Proliferación - Diferenciación - Inmunofenotipo 2. Efectividad “in vivo” del transplante de MSCs autólogas en el tratamiento de lesiones del aparato locomotor en caballos
  • 6. Financiación PAMER 2010 1.Caracterización de MSCs: - Proliferación - Diferenciación - Inmunofenotipo - Papel antiproliferativo e inmunomodulador “in vitro”
  • 7. EXPRESIÓN RELATIVA DE mRNA DE ANTÍGENOS DE SUPERFICIE AT-MSC BM-MSC * p<0,05, n= 5.
  • 8. ESTUDIOS DE PROLIFERACIÓN - > Proliferación en las MSCs obtenidas de tejido adiposo - Grandes diferencias individuales
  • 9. DIFERENCIACIÓN A OSTEOCITO, ADIPOCITO Y CONDROCITO Prolongaciones citoplasmáticas que les permiten establecer contacto con otras células El aspecto del nucleolo indica una alta actividad de síntesis en los ribosomas
  • 10. EXPRESIÓN RELATIVA mRNA EN MARCADORES ESPECÍFICOS OSTEOGÉNESIS ADIPOGÉNESIS BM-MSCs Expresión en todos los casos entre controles y células diferenciadas excepto COL1A1 p<0,05 ** p<0,01 *** p<0,001, n= 5.
  • 11. Financiación PAMER 2010 1.Caracterización de MSCs: - Proliferación - Diferenciación - Inmunofenotipo 2. Efectividad “in vivo” del transplante de MSCs autólogas y heterólogas en el tratamiento de lesiones del aparato locomotor en caballos
  • 12. Financiación PAMER 2010 2. Efectividad “in vivo” del transplante de MSCs autólogas y heterólogas en el tratamiento de lesiones del aparato locomotor en caballos
  • 13. ENSAYO I: MSCs EN TRATAMIENTO DE LESIONES NATURALES Implante autólogo de MSCs en pacientes con tendinitis del hospital veterinario Tendones flexores digitales (superficial y profundo) y del Caso clínico USO CLÍNICO DE MSCs EN LESIONES NATURALES ligamento suspensor del menudillo Ninguno de los caballos tratados con implante autólogo de MSC han ENSAYO II: MSCs EN TRATAMIENTO DE LESIONES INDUCIDAS Lesión: Ligamento suspensor del menudillo en extremidad mostrado reacciones adversas serias, sistémicas o locales, tras el posterior (Corte sagital) tratamiento Implante autólogo de MSCs en caballos de experimentación La evolución ecográfica muestra una marcada mejoría de las lesiones, en comparación con la evolución esperada en lesiones similares tratadas convencionalmente ENSAYO III: MSCs HETEROLOGAS EN ARTICULACION La mayoría de los casos muestran una reparación ecográfica prácticamente completa a partir de los 6 meses del tratamiento (ecogenicidad y orientación fibrilar) Pre-inyección 1 mes post- 3 meses post- 8 meses post- tratamiento tratamiento tratamiento
  • 14. ENSAYO II: MSCs EN TRATAMIENTO DE LESIONES INDUCIDAS Implante autólogo de MSCs en caballos de experimentación … … en el tratamiento de lesiones naturales hemos visto que la evolución es buena, pero con lesiones inducidas en animales de experimentación : MATERIAL ANIMAL UNIFORME (sexo, peso…) MATERIAL ANIMAL UNIFORME (sexo, peso…) LESIONES BILATERALES SIMILARES CONTROLES FACTORES DE CRECIMIENTO ó MSCs? ANÁLISIS POST-MORTEN
  • 15. ENSAYO II: MSCs EN TRATAMIENTO DE LESIONES INDUCIDAS Implante autólogo de MSCs en caballos de experimentación con tendinitis inducidas 24 lesiones inducidas mecánicamente en caballos de experimentación (12 animales). 12 CABALLOS Lote A: 6 tratado sólo con fPRP 6 Lote B: tratado con FT-MSCs y resuspendidas en RL 3 Lote C: tratado 3 3 3 con BM-MSCs y resuspendidas en RL Lote D: tratado IZDA DRCHA IZDA sólo con RL DRCHA IZDA DRCHA IZDA DRCHA BM PRPs BM RL FT PRPs FT RL (B) (A) (B) (D) (C) (A) (C) (D) Valoración clínica y ecográfica. Caracterización genética, bioquímica, histológica, mecánica y funcional del tejido regenerado.
  • 16. FACULTAD DE VETERINARIA Inmaculada Martín Rosario Osta Pilar Zaragoza Paco Vázquez Antonio Romero Beatriz Ranera Ana Rosa Remacha Jaber Lyahyai Fernanado Fernandes FACULTAD DE MEDICINA Maria Luisa Bernal Jorge Albareda Concha Junquera CPS (Grupo GEMM) Manolo Doblare José Manuel García CIEMAT Rosa Yañez