La producción in vitro de embriones bovinos implica 3 etapas: maduración in vitro de los ovocitos, fertilización in vitro y cultivo in vitro de los posibles cigotos. El documento describe cada una de estas etapas, incluyendo la recolección y transporte de los ovarios, la maduración de los ovocitos, la preparación de los espermatozoides, la fertilización in vitro y el cultivo de los embriones. El objetivo final es producir embriones viables que puedan ser transferidos a vacas receptoras.

1. REVISION BIBLIOGRAFICA DE PRODUCCION IN VITRO DE
EMBRIONES BOVINOS.
1.
Estudiante de Biotecnología, Universidad de Córdoba, Departamento
de Ciencias Basicas, Facultad de Quimica. Montería, Colombia.
La producción in vitro de embriones bovinos es el procedimiento para
producir embriones en 3 etapas, maduración in vitro (MIV),
fecundación in vitro (FIV) y cultivo in vitro (CIV) de los posibles
cigotos.
El desarrollo in vitro de los ovocitos está íntimamente relacionado con
la aptitud que adquieren durante su etapa folicular previa. Para una
mayor comprensión de los eventos que ocurren in vitro y de los
factores que los afectan se considerará resumidamente el desarrollo
folicular y ovocitario in vivo e in vitro.
El folículo es una estructura ovárica con dos funciones, producción de
hormonas y de ovocitos aptos para ser fecundados. Las mismas son
llevadas a cabo por los folículos antrales, los cuales poseen una pared
interna de células de la granulosa que se apoyan sobre la membrana
basal. Esta matriz extracelular separa las capas epiteliales del
mesénquima y afecta la migración celular, proliferación y
diferenciación de las células que se apoyan en ella. (1)
A pesar de que cada ovario posee cientos de miles de oocitos al
momento del nacimiento de una hembra, la mayoría se pierden por
atresia en un proceso que comienza después del nacimiento.
Esta tremenda perdida de material genético puede ser reducida por la

2. recuperación de oocitos desde los ovarios y el uso de la técnica de
producción in vitro de embriones –PIVE
La PIVE es una técnica que bien manejada puede conducir a un
aprovechamiento mucho más significativo del material genético de una
hembra de alto merito. Los rasgos deseables en los animales pueden
ser potenciados con la escogencia adecuada del origen de los oocitos y
el semen para el proceso, tal como en un esquema de selección y
apareamientos dirigidos para mejoramiento genético. Además
mediante procedimientos de ingeniería genética, es factible realizar
manipulaciones sobre gametos y embriones conducentes a establecer
rasgos deseables en una población animal.
Para Colombia el hecho de establecer una biotecnología con la
magnitud e importancia mundial de la PIVE en sus procedimientos de
mejora genética y reproductiva, puede ser vital para la competitividad
futura del sector. La PIVE no sólo puede ser beneficiosa para el país en
éstos sentidos, sino que puede y debe representar, como en otros
países, una base para el desarrollo de actividades investigativas y
comerciales, y para el desarrollo de otras biotecnologías
Asociadas (2)
DESARROLLO DE EL FOLICULO EN LA HEMBRA
El folículo es una estructura que se compone originalmente del ovocito
cubierto de células pre-granulosas (folículo primordial, foto 1). El
número de los mismos es diferente según la especie y depende
también en forma directa del peso de los animales (3).

3. Al nacimiento las terneras poseen 105 aproximadamente. Ese número
tiene la particularidad de no aumentar, por el contrario el mismo
disminuye con la edad. Una ternera sana cuenta con 120 000 a 150
000 folículos primordiales y primarios (foto2), 200 a 500 folículos
secundarios (foto 3) en crecimiento y 20 a 50 antrales (foto 4)
Los folículos antrales tienen la particularidad de mantener el arresto
meiótico de ovocito (fotos 4 y 5). La segunda división meiótica del
ovocito se detiene durante el crecimiento folicular y se reinicia recién
después de la liberación (ovulación) o fecundación. In vitro, la división
meiótica puede continuar en forma espontánea cuando después que el
ovocito abandona el folículo (4)
Los folículos antrales de bovinos y ovinos, de 0,20 mm de diámetro,
requieren aproximadamente 40 días para alcanzar el estado

4. preovulatorio (5).
Su crecimiento depende de un coordinado proceso de replicación y
diferenciación de sus células y se puede dividir en 2 fases. La primera,
hasta un tamaño de 4 mm, depende de la proliferación de las células
de la granulosa y no es estrictamente dependiente delestado
hormonal. Su desarrollo podría depender de factores de crecimiento
(growth factors) a través de una regulación parácrina (6)
La segunda fase es la que comprende el desarrollo final del folículo
hasta su estado preovulatorio. En ese proceso la hormonas LH y FSH
juegan un rol preponderante. Los factores de crecimiento también
participan ejerciendo la modulación local del crecimiento del folículo
antral (7), estimulando la proliferación, diferenciación y
esteroideogénesis de la pared del folículo. (8)
Los folículos pueden sufrir la atresia en cualquier momento de su
desarrollo. En la dinámica folicular, unos forman parte del pool de
crecimiento mientras otros ovulan o se atresian. Durante el
crecimiento, la mayor parte de ellos continuarán con atresia, sin
embargo los folículos que no se encuentran en crecimiento también se
atresian.
RECOLECCIÓN Y TRANSPORTE DE LOS OVARIOS
La obtención de ovarios después de el sacrificio es la forma más
común y económica de obtener los ovocitos con fines experimentales y
comerciales. Es la que permitió el desarrollo de la producción in vitro
de embriones bovinos y la que dio comienzo a la producción de
embriones en gran escala (9)

5. La recolección de ovarios en matadero se realiza removiendo los
ovarios del tracto reproductivo de la vaca inmediatamente o máximo
10 minutos después de retirado de la canal. Los ovarios son puestos
en un contenedor con solución salina fisiológica (0.9% NaCl) con 100
µm/ml de estreptomicina y 100 IU/ml de penicilina, dentro de un
termo, a una temperatura cercana a 37°C. Una cuidadosa observación
de la temperatura de la solución salina es importante para mantener la
viabilidad de los ovarios. Pueden emplearse dos contenedores
utilizando uno de ellos para el lavado de los ovarios y el segundo para
su almacenamiento. Los ovarios deben transportarse inmediatamente
al laboratorio. Es recomendable que los oocitos sean recolectados
desde los ovarios dentro de un periodo de 6 horas de recolectados los
ovarios, después de este tiempo su potencial de desarrollo se ve
altamente comprometido (10, 11).

6. Los CCO’s se clasifican de acuerdo con la cantidad y calidad de capas
de células del cúmulus y la apariencia de su ooplasma. De estas
categorías en general se considera que solamente los oocitos tipo 1 y
2 poseen un elevado potencial para desarrollarse en embriones por
FIV (12)
Categorías de complejos cumulus oocito (CCO) para procedimientos de PIVE.
Fuente: Lindner y Wright (1983)
MADURACIÓN IN VITRO DE LOS OVOCITOS
Cuando los ovocitos son retirados de los folículos terciarios y
cultivados in vitro, la maduración ocurre tanto en el núcleo como en su
citoplasma. La maduración nuclear ocurre en forma espontánea
(12,13,14).
La primera modificación visible del núcleo es la condensación de la
cromatina y la disolución de la membrana nuclear, proceso conocido
como ruptura de la vesícula germinativa (Geminal Vesicle Breakdown,
GVBD).
El medio usado para la maduración invitro de oocitos varía entre
laboratorios. Estos medios pueden clasificarse en simples y complejos.
Los medios simples son usualmente sistemas buferados con
bicarbonato, contienen sales fisiológicas básicas con piruvato, lactato y
glucosa. El medio es generalmente suplementado con suero o
albúmina, y con cantidades traza de antibióticos como penicilina,

7. estreptomicina, anfotericina y gentamicina. Los medios complejos
contienen principalmente a los niveles en que son encontradas en el
suero. El medio más ampliamente usado para MIV en ganado y búfalos
es el medio de cultivo de tejidos 199 (TCM 199) con sales Earle’s,
glutamina y 25mM de Hepes, suplementado con 10 a 20% de suero
inactivado por calor (suero de ternero fetal, suero de ternero, o suero
de vaca en estro). Otros medios usados son Ham’s F10,MEM, IVMD
101, RPMI, y fluido oviductal bovino sintético (SOF), entre otros.
Algunas hormonas son suplementadas, incluyendo FSH, LH, estradiol y
prolactina. La acción directa de estas hormonas en la MIV y el
desarrollo temprano de embriones no esta totalmente establecida,
pero su adición al medio de cultivo mejora el desarrollo de embriones
preimplantatorios.
La preparación de cajas (petri de 30mm) de medio de maduración se
realiza con microgotas de 50µl de medio, cubiertas con
aproximadamente 3 ml de aceite mineral (ver imagen 5), colocando 10
oocitos por gota (15).
El uso de microgotas bajo aceite mineral para la MIV, tiene como
ventajas que previene o reduce la evaporación del agua, protege
contra la contaminación, atenúa las fluctuaciones de gases y
temperatura, y facilita la evaluación durante el cultivo. Hay una
diferencia significativa en producción de blastocistos a favor de la MIV
por un periodo de 24 horas. Otras consideraciones son que los oocitos
y embriones no deben ser expuestos a periodos prolongados de luz, la
temperatura benéfica para el desarrollo está entre 38 y 39®¨C, al
igual que el mejor ambiente gaseoso es 5% CO2, 5% O2 y 90% N2
El desarrollo de blastocistos se reduce después de la MIV de oocitos
bajo una atmósfera de cultivo de 5% CO2, 7% O2, y 88% N2,

8. comparado con una atmósfera de 5% CO2 en aire.(16)
Microgotas para PIVE bajo aceite mineral
PREPARACIÓN DE LOS ESPERMATOZOIDES
Capacitación espermática (CE) y reacción acrosómica (RA): Es la
condición fisiológica que deben cumplir los espermatozoides para
adquirir su capacidad fecundante in vivo (17,18).
Ello se cumple a través de remoción de los factores decapacitantes,
derivados de las vías genitales masculinas y de la interacción de las
células espermáticas con los llamados "factores capacitantes", que se
encuentran en el tracto genital femenino. Esa capacidad se

9. desencadena a partir de la eyaculación en el tracto genital femenino y
en el curso de la migración espermática, razón por la cual depende del
ciclo estral y en consecuencia de la regulación hormonal
El proceso de FIV implica la preparación de un gradiente percoll, PHE
(mezcla de hipotaurina, penicilamina y epinefrina), heparina, medio de
fertilización y la preparación del semen (19).
.
La preparación del semen para la FIV usualmente involucra
procedimientos para separar los espermatozoides del plasma seminal,
diluyentes y/o crioprotectores. También pueden mejorar el porcentaje
de espermatozoides motiles y/o normales usados para FIV. Las
técnicas usadas para estos propósitos incluyen swimup, gradiente
percoll y glass wool. El procedimiento percoll es más rápido y produce
hasta 6 veces una mayor recolección de espermatozoides motiles que
elmétodo swimup (20), percoll es superior en la selección de es
permatozoides con morfología normal, por lo que puede incrementar
las tasas de fertilización (21).
Semen + gradiente percoll para la selección de espermatozoides
FERTILIZACION IN VITRO (FIV)

10. El medio de fertilización puede ser preparado mediante un medio stock
compuesto por una combinación de sales más lactato, con
suplementación por albúmina sérica bovina libre de ácidos grasos
(BSAFAF), piruvato y antibióticos . En ganado y búfalos la FIV de
oocitos madurados in vitro, es usualmente comenzada después de 22
a 24 horas de MIV porque el pico de oocitos en etapa de metafase II
se da en este periodo. Para facilitar la penetración espermática en la
FIV, los oocitos pueden ser parcialmente denudados de células del
cumulus . Como procedimiento para la FIV se preparan cajas de petri
con gotas de 44µl de medio de fertilización, cubiertas con
aproximadamente 3 ml de aceite mineral para luego de un periodo de
preincubación de las gotas de mínimo de 2 horas, pasar 10 oocitos a
cada gota, previamente retirados del medio de maduración y lavados
en Hepes. Luego se adiciona 2µl de heparina, PHE y semen
previamente preparados, para completar gotas de medio para FIV de
50µl. Los oocitos
deberán permanecer en incubación durante 18 horas para lograr la
FIV.
CULTIVO IN VITRO (CIV)
El cocultivo de oocitos y semen para FIV debe hacerse en un ambiente
de 5% CO2, 38.9ºC de temperatura, y humedad maxima por 18 horas
(15).
Los cigotos bovinos madurados y fertilizados in vitro, fueron
inicialmente cultivados con células del cúmulus, células epiteliales
oviductales, células de la granulosa, células del amnios, y células de
hígado de rata búfalo en TCM199 suplementado con suero bovino,
produciendo embriones con citoplasma oscuro y baja densidad. El

11. medio CR1aa fue luego desarrollado para el cultivo in vitro y según
varios estudios, CR1aa es superior a TCM199 para el desarrollo
potencial a blastocistos, con o sin cocultivo con células de la granulosa
(22).
El fluido oviductal sintético (SOF) ha sido utilizado para la PIVE y
principalmente para el CIV.
Gandhi et al. (23), utilizaron medios de cultivo a partir de SOF con
albúmina sérica bovina (BSA) o suero de ternero bovino (BCS) como
medios únicos para MIV, FIV y CIV, concluyendo que un medio simple
puede ser usado satisfactoriamente durante la maduración,
fertilización y desarrollo embrionario pre implantación.
El CIV se realiza preparando el medio de desarrollo (Ej. CR1 AA,
SOFaa) con gotas de 50 µl bajo aceite mineral en cajas de petri de
30mm, a las cuales son transferidos 10 presuntos cigotos por gota,
una vez retirados del medio para FIV y lavados en Hepes. El cultivo de
embriones es realizado en una incubadora con aire humidificado, con
5% CO2 a 38ªC. La observación de la tasa de clivaje es realizada
aproximadamente 32 horas después del inicio del CIV, mientras la
observación del desarrollo de embriones preimplantatorios es hecha a
los 7 a 10 días de CIV (15).
Aproximadamente el 80% de los oocitos quedan fertilizados y clivan
hasta el estado de dos células después de MIV, FIV, y de éstos solo
llegan el 40% de los embriones al estado de blastocisto después de
CIV
.

12. REFERENCIAS
1. Palma, G. Biotecnología de la reproducción. Producción In vitro de
embriones bovinos. INTA. Argentina, 2001; 313-358.
2. Mapletoft J, Hasler F. Assisted reproductive technologies in cattle: A
review. Rev Sci tech off Int,Epiz 2005;24(1)393403.
3. Gosden RG and E Telfer (1987) Number of follicles in mammalian
ovaries and the allometric relations J Zool Lond 211,169-175.
4. Pincus G and EV Enzmann (1935) The conmparative behavior of
mamalian eggs in vivo and in vitro J Exp Med 62, 665-675.
5. Kruip Th AM, Boni R, Würth AA, Roelfsen MWM and MC Pieterse
(1994) Potencial use of OvumPick-Up for embryo production and
breeding in cattle J of Dairy Sci 75,2857-2879.
6. 7. Monniaux D, Monget P, Besnard C, Huet C and C Pisselet (1997)
Growth factors and antral follicular development in domestic rumiants
Theriogenology 47, 3-12.
8. Parrish JJ, Kim CI, IH Bae (1992) Current concepts of cell-cycle
regulation and its relationship to oocyte maturation, fertilization and
embryo development Theriogenology 38, 277-296
9. Lu KH and C Polge (1992) A summary of two years results in large
scale in vitro bovine embryo production Proceedings of the 12th
International Congress on Animal Reproduction, The hague 3, 1315-
1317
10. Duran, 1999 Duran D. Technical aspect of in vitro embryo
production, Embryo Technology Laboratory Phylippine Carabao Center,
1999
11. Ferguson y Leese, 1999; Ferguson E, Leese H. Tryglyceride
content of bovine oocytes and early embryos. Journal of Reproduction
Fertility 1999;116:373378

13. 12. Lindner G, Wright W. Bovine embryo morphology and evaluation.
Theriogenology 1983;20:407416
12. Donahue R (1968) Maturation of mouse oocyte in vitro Sequence
and timing of nuclear progression J Exp Zool 169, 237-250
13. Thibault C (1977) Are follicular maturation and oocyte maturation
independent process? J ReprodFertil 51, 1-15
14. Sirard MA, Coenen, K (1993) The co-culture of cumulus enclosed
bovine oocytes and hemisections of follicles, effects on meiotic
resumption Theriogenology 40, 933-942
15. Tarazona A, Olivera M, Ruiz Z. Protocolos para la producción in
vitro de embriones, grupo Syngamia, Universidad de Antioquia, 2006.
16. Watson et al., (2000) Watson A, De Sousa P, Caveney A, Barcroft
l, Natale D, Urquhart J,Westhusin M. Impact of bovine oocyte
maturation media on oocyte transcript levels blastocyst development
cell number and apoptosis. Biol Reprod 2000;62:355364
17. Chang MC (1951) Fertilizing capacity of spermatozoa deposited in
Fallopian tubes Nature 168, 997-998
18. Austin CR (1951) Observations on the penetration of the sperm
into the mammalian egg Aust J Sci Res 4, 581-596
19 . Amirat l, Neira A. Protocole de fecondation in vitro chez les
bovines, Ecole nationale veterinaire de nantes 20002001
20. Parrish J, Krogenaes A, SuskoParrish J. Effect of bovine sperm
separation by either swimup or percoll method on success of in vitro
fertilization and early embryonic development. Theriogenology
1995;44:859869
21. Prakash P, Leykin l, Chen Z, Toth T, et al. Preparation by
differential gradient centrifugation is better than swimup in selecting
sperm with normal morphology, strict criteria. Fertility and Esterility
1998;69(4).

14. 22. Imai K, Matoba S, Dochi O, Shimohira I. Different factors affect
developmental competence and cryotolerance in in vitro produced
bovine embryo. Journal of Veterinary Medicine Science
2002;64(10)887891.).
23. Gandhi A, Lane M, Gardner D, Krisher R. A single medium supports
development of bovine embryos throughout maturation fertilization
and culture. Human Reproduction 2000;15(2):395401.