Proteínas i

PROTEÍNAS I
(Ensayos de reconocimiento de proteínas)
Objetivo: El objetivo de esta experiencia es extraer proteínas de algunas
sustancias para luego reconocer su naturaleza proteica. Para esto utilizaremos
los ensayos de Biuret y Xantoproteico y ciertas muestras de leche, gelatina,
clara de huevo, aspartamo y glicina.
Materiales: Reactivos utilizados:
Vaso de Bohemia Leche descremada en polvo
Varilla de vidrio Gelatina
Mechero Clara de huevo
Soporte Edulcorante
Tela metálica Acido etanoico
Gradilla NaOH
Tubo de ensayo CuSO4
Termómetro Ácido nítrico concentrado
Papel de filtro Agua
Ensayo de Biuret:
Está hecho de hidróxido potásico (KOH) y sulfato cúprico (CuSO4), junto
con tartrato de sodio y potasio (KNaC4H4O6·4H2O). El reactivo, de color azul,
cambia a violeta en presencia de proteínas, y vira a rosa cuando se combina
con polipéptidos de cadena corta. El Hidróxido de Potasio no participa en la
reacción, pero proporciona el medio alcalino necesario para que tenga lugar.
Consiste en tratar una proteína o péptido con Cu++
en medio alcalino,
produciéndose una coloración violácea por formación de un complejo de
coordinación entre el Cu++
y los pares electrónicos libres de los nitrógenos de
los grupos amino de la unión peptídica. Son necesarias por lo menos dos
uniones peptídicas para que tenga lugar la reacción.
La reacción del biuret no es una reacción específica para proteínas. Eso hace
que un resultado positivo con este reactivo deba ser cuidadosamente evaluado
para descartar los resultados falsos positivos
Un resultado negativo de la reacción del biuret sobre una muestra problema no
necesariamente indica la ausencia de proteínas, ya que puede ocurrir a) que no
existan proteínas o péptidos en la muestra (ni tampoco otras sustancias no proteicas

biuret positivas), b) que existan una o más sustancias interferentes en la
muestra que impidan que se produzca la reacción (lo que daría lugar a un
resultado falso negativo). Esto puede descartarse (o evitarse) si conozco de
antemano la composición aproximada de la muestra. Por ejemplo, si deseo
determinar el contenido de péptidos generados por una reacción de hidrólisis
ácida, los H+
del medio interferirán con la reacción del biuret, ya que ésta
necesita de un medio alcalino para la formación del complejo con Cu++
. En este
caso la interferencia puede eliminarse alcalinizando el medio antes de realizar
el ensayo (en caso contrario obtendría un falso negativo como resultado)
y c) Que existan péptidos, pero a una concentración inferior al límite de
sensibilidad del método. Todo método permite determinar la presencia de un
compuesto sólo si la concentración del mismo es superior a cierto valor.
Existen métodos mucho más sensibles que el biuret (ver más abajo).
¿Cómo se lleva a cabo la reacción de Biuret?
La Prueba de Biuret es un ensayo general para las proteínas. Cuando una
proteína reacciona con el cobre (II) sulfato (azul), la prueba positiva es la
formación de un complejo de color violeta.

Ensayo de Xantroproteíco:
Esta reacción se usa para detectar la presencia de proteínas solubles en una
solución. Se realiza mediante el uso de HNO3 concentrado que, en presencia
de proteínas o aminoácidos con restos aromáticos torna la solución de un color
amarillo oscuro.
Los anillos fenilo que contengan un grupo activante pueden ser nitrados
produciendo un compuesto Amarillo. La producción de un producto coloreado
Amarillo al añadir ácido nítrico es una prueba para la presencia de tirosina o
triptófano en una proteína. La adición de base fuerte hace que el color se torne
más oscuro hacia anaranjado. Las manchas amarillas en la piel causadas por
ácido nítrico son el resultado de la reacción xantoproteíca.
La reacción xantoproteica se puede considerar como una sustitución
electrofilica aromática de los residuos de tirosina de las proteínas por el acido
nítrico dando un compuesto coloreado amarillo a pH acido.
¿Cómo se lleva a cabo la reacción xantoproteica?
Se representa la producción de un producto de color amarillo en la adición de
ácido nítrico.realizado en un ensayo para detectar la presencia de tirosina y
triptófano en una proteína.

CASEINA:
La caseína (del latín caseus,
"queso") es una fosfoproteína (un
tipo de heteroproteína) presente
en la leche y en algunos de sus
derivados (productos fermentados
como el yogur o el queso). En la
leche, se encuentra en la fase
soluble asociada al calcio (fosfato
de calcio) en un complejo que se
ha denominado caseinógeno.
A diferencia de muchas otras
proteínas, incluso del queso, las
caseínas no precipita por acción
del calor. Por el contrario,
precipita por la acción de una enzima proteasa presente en el estómago de los
mamíferos llamada renina y forma un precipitado denominado paracaseína. Si
la precipitación se realiza por la acción de ácidos, se le llama caseína ácida. En
la elaboración de los quesos tienen lugar ambos tipos de precipitaciones.
Cuando se emplea la enzima tripsina, la caseína se hidroliza a una molécula
fosfatada llamado pepto.
Otro dato interesante, utilizado para separar las caseínas del resto de las
VACAS proteínas lácteas mediante su precipitación, es que su punto
isoeléctrico (pI) promedio es de 4,6. A este pH, las caseínas se encuentra en
su punto de menor solubilidad debido a la reducción de las repulsiones
intermoleculares, por lo que precipitan (vulgarmente se dice que coagulan).
Ahora bien, el pI es diferente para cada una de las fracciones caseínicas, ya
que varía entre el 4,44-4.97 para la αs1-caseína y el 5,3-5,8 en la variante
genética B de la κ-caseína.

Comenzamos por colocar una punta de espátula de leche en polvo y le
agregamos agua para luego calentarla hasta aproximadamente 40 grados,
agitando siempre con una varilla de vidrio. Luego adicionamos ácido etanoico
2,0M (gota a gota) agitando en forma continúa hasta coagulación total.
Separamos el coagulo de caseína del suero. Secamos cuidadosamente la
caseína con papel de filtro. Por último lo dividimos en dos partes y las
colocamos cada una en un tubo de ensayo.
En el tubo 1, practicamos el ensayo
de Biuret: este consiste en agregar
20 gotas de NaOH al 10% y luego
agregamos 3 gotas de CuSO4al 1%.
Como el color de ésta es violeta por
lo tanto podemos decir que
existen por lo menos dos enlaces
peptídicos.
En el tubo 2, realizamos el
ensayo Xantoproteico, que consiste
en agregarle al solido 10 gotas de
HNO3 concentrado. El producto
coloreado de Amarillo es una prueba
de la presencia de tirosina o
triptófano en la caseína.

GELATINA:
La gelatina es una mezcla coloide (es decir, una
sustancia semisólida), incolora, translúcida,
quebradiza e insípida, que se obtiene a partir del
colágeno procedente del tejido conectivo de
animales hervidos con agua. También existe una
gelatina vegetal conocida como agar-agar. La
gelatina es una proteína compleja, es decir, un
polímero compuesto por aminoácidos. Como
sucede con los polisacáridos, el grado de
polimerización, la naturaleza de los monómeros y la secuencia en la cadena
proteica determinan sus propiedades generales. Una notable propiedad de las
disoluciones de esta molécula es su comportamiento frente a temperaturas
diferentes: son líquidas en agua caliente y se solidifican en agua fría.
Al ser proteína en estado puro, ésa es su mayor propiedad nutritiva: proteína
(84-90%), sales minerales (1-2%) y agua (el resto). La gelatina se utiliza en la
fabricación de alimentos para el enriquecimiento proteínico, para la reducción
de hidratos de carbono y como sustancia portadora de vitaminas.
La gelatina cuaja cuando está a la temperatura ambiente, a 18 °C o menos,
pero siempre por encima del punto de congelación. Si se le calienta a 27 °C,
poco a poco se convertirá en una mezcla acuosa; si se le enfría, volverá a
cuajar. Este comportamiento está determinado por un ingrediente especial que
cuaja la mezcla: la grenetina, que está hecha de colágeno, proteína fibrosa que
se encuentra en el tejido conjuntivo del cuerpo
Realizamos una solución de clara
de huevo y agua y utlizamos la
técnica pasada para la búsqueda
de presencia de proteínas.
En el tubo 1 se practico la
reacción de biuret. La muestra se
torna color violeta entonces
estamos en presencia de por lo
menos dos enlaces peptídicos.
En el tubo 2 se practico la
xantoproteica. La muestra resulta
incolora es decir que da negativa
y deducimos que la gelatina no
presenta tirosina o triptófano.

La ovoalbúmina es la principal proteína
de la clara del huevo (60-65% del peso
de la clara de huevo). Pertenece a la
superfamilia proteínica de las serpinas,
aunque a diferencia de la mayoría de
éstas la ovoalbúmina no es capaz de
inhibir cualquier peptidasa. La función
biológica de la ovoalbúmina es
desconocida, aunque se presume que
sea una reserva de proteínas para la cria
del ave. Otros autores señalan la
capacidad que posee la ovoalbúmina de
anular las enzimas digestivas y por esta razón señalan que es un mecanismo
protector contra las bacterias exteriores agresoras al huevo. La ovoalbúmina (y,
de hecho, toda la clara del huevo, también llamada albumen) no forma parte
del óvulo original ni de sus cubiertas, sino que se forma por secreciones
(mayoritariamente proteicas) del epitelio del oviducto durante su paso por él.
Rompimos un huevo separando
la clara de la yema. Colocamos
la clara en agua y
homogeneizamos. Colocamos
parte de la solución en dos tubos
de ensayo y realizamos los
ensayos mostrados
anteriormente.
Tubo 1 Biuret positivo: presenta
por lo menos dos o más enlaces
peptidicos.
Tubo 2 Xantoproteica positivo:
presencia de tirosina o triptófano
en la ovoalbúmina.

ASPARTAMO:
El aspartamo o aspartame, es un edulcorante no calórico descubierto en 1965
por la multinacional farmacéutica G.D. Searl and Company El aspartamo es
estable cuando se encuentra seco o congelado, pero se descompone y pierde
su poder edulcorante con el transcurso del tiempo, cuando se conserva en
líquidos a temperaturas superiores a 30 º. El aspartamo es de 150 a 200 veces
más dulce que el azúcar. Todos los edulcorantes se clasifican con respecto a la
sacarosa o azúcar común, por lo que el valor de 200 veces se obtiene al
compararlo con diluciones hechas en laboratorio de sacarosa (dulzura relativa
= 100) al 15%. El aspartamo es el metiléster de dos aminoácidos naturales, el
ácido aspártico y la fenilalanina, que se hidroliza liberando ambos aminoácidos
y metanol, que es oxidado a formaldehído por el alcohol deshidrogenasa,
presente en muchos tejidos. La presencia de restos de formaldehído en
muchos tejidos demuestra que la hidrólisis no tiene lugar, al menos en su
totalidad, en el intestino, sino que se produce en los tejidos, liberando
formaldehído (o su producto de
oxidación, ácido fórmico) en ellos,
tal como ya fue demostrado a
finales de los noventa 8 , el
llamado "Estudio Barcelona". El
metanol es también tóxico por sí
mismo, dándose la circunstancia
que la ingesta máxima permitida de
aspartamo puede liberar una
cantidad de metanol por encima de
la dosis máxima diaria permitida
para este alcohol.
Ambos ensayos dan negativos por
lo tanto no presenta enlaces
peptidicos y tampoco
presenta tirosina o triptófano

GLICINA:
La glicina o glicocola (Gly, G) es uno
de los aminoácidos que forman las
proteínas de los seres vivos. En el
código genético está codificada como
GGT, GGC, GGA o GGG. Es el
aminoácido más pequeño y el único no
quiral de los 20 aminoácidos presentes
en la célula. Su fórmula química es
NH2CH2COOH y su masa es 75,07.
La glicina es un aminoácido no
esencial. Otro nombre (antiguo) de la
glicina es glicocola. La glicina actúa
como neurotransmisor inhibidor en el sistema nervioso central. Fue propuesta
como neurotransmisor en 1965.
La glicina se utiliza -in vitro- como medio gástrico, en disolución 0,4 M,
amortiguada al pH estomacal para determinar bioaccesibilidad de elementos
potecialmente tóxicos (metales pesados) como indicador de biodisponibilidad.
La glicina no es esencial en la dieta humana, ya que el propio cuerpo se
encarga de sintetizarla. Todas las células tienen capacidad de sintetizar glicina.
Hay dos vías para sintetizarla: la fosforilada y la no-fosforilada. El precursor
más importante es la serina. La fosfoserina fosfatasa, desfosforila a la
fosfoserina hasta serina. La enzima serina hidroximetil transferasa da lugar a la
glicina a partir de la serina. La glicina usada como neurotransmisor es
almacenada en vesículas, y es expulsada como respuesta a sustancias.
Industrialmente se prepara mediante una reacción de un solo paso entre el
ácido cloroacético y el amoníaco.
ClCH2COOH + NH3 → H2NCH2COOH + HCl.
La reacción da negativa en ambos
casos y pos lo tanto deducimos que
la glicina no presenta enlaces
peptidicos y tampoco
presenta tirosina o triptófano.

TABLA DE RESULTADOS
MUESTRA BIURET XANTOPROTEICO
Caseína + +
Gelatina + -
Ovoalbúmina + +
Aspartamo - -
Glicina - -
Errores sistemáticos y asistemáticos de la práctica tenidos en cuenta
son:
En el transcurso de la práctica, las mediciones fueron a ojo y con un gotero, por
lo que no fue utilizada una pipeta graduada. Esto trae con sigo errores ya que
la medida exacta de reactivo fue tomada con un error mínimo para todos los
casos y así con las muestras.
También la limpieza de los tubos de ensayo puede llevar a errores, ya que a
pesar de que los tubos fueron previamente limpiados, podrían haber tenido
algún residuo.
Otro factor del error a tener en cuenta es a la temperatura a la que llevamos la
gelatina que pudo no haber alcanzado para reaccionar completamente. Otro
factor pudo haber sido el estado de los reactivos o muestras, como por ejemplo
la leche que pudo haber estado en mal estado.

PROTEÍNAS 2: diálisis
FUNDAMENTO TEÓRICO:
La purificación de proteínas consiste en tomar una alícuota del precipitado y
dializar mediante el flujo selectivo de materia de una zona de mayor
concentración a otra de menor concentración con ayuda de presión osmótica,
es decir, separando dos disoluciones de concentraciones diferentes por una
membrana semi permeable (una membrana que permite el paso selectivo de
las moléculas del disolvente, pero impide el paso de compuestos de mayor
peso molecular).
De ésta manera se puede concentrar un producto o separarlo de una mezcla
de moléculas. Es necesario realizar éste paso a baja temperatura y en
agitación constante, ya que la diálisis es un proceso molecular que depende
exclusivamente de los movimientos aleatorios de las moléculas individuales
Materiales:
Dializador
Vaso de Bohemia
Gelatina en solución
AgNO3 (Nitrato de Plata)
NaOH al 10%
CuSO4 al 1 %

¿Qué criterio se utiliza para determinar si el ensayo de biuret resulta
positivo o negativo?
El criterio para determina si la muestra de estudio resulta positiva o negativa
,se debe a que el reactivo, de color azul, cambia a violeta en presencia
de proteínas, y vira a rosa cuando se combina con polipéptidos de cadena
corta, por lo cual si la solución final nos da una coloración violeta , se refiere a
que se ha detectado una presencia de proteínas o mejor dicho de enlaces
peptidicos.
¿Para qué es necesario el Nitrato de Plata en este práctico?
Como dijimos con antes, la solución que se coloca en el instrumento tiene
además de proteínas, sales y el nitrato de plata diriamos que es un
determinador de sales en una solucion .
El cloruro de plata es un sólido blanco, y su formación determina que el ensayo
sea positivo o negativo
En agua, tanto el nitrato de plata como el cloruro de sodio de disocian de la
siguiente manera:
Reacción:
AgNO3 (Ag +) + (NO3-) (ac)
Catión Plata Anión Nitrato
NaCl (Na+) + ( Cl -) (ac)
Catión Sodio Anión Cloruro
Luego:
(Ag+) (ac) + (Cl-) (ac) AgCl (s)

Procedimiento de la práctica:
Colocamos una solución dentro del dializador (ovoalbumina y NaCl) y, tomando
dos pequeñas muestras, la testeamos en busca de sales y proteínas
(realizamos práctica con AgNO3 y ensayo de Biuret, ambos de los cuales
fueron positivos. Luego, colocamos el instrumento dentro de un vaso de
Bohemia con agua, y luego de un tiempo, se tomo pruebas de biuret y AgNO3
dentro y fuera del dializador.
Azul - proteinas y rojo - sales
BIURET AgNO3
INTERIOR + +
EXTERIOR - +

Baso de Bohemia que contenía agua destilada:
a) Biuret: NEGATIVO
b) AgNO3: POSITIVO
A partir de esto, podemos ver
que el AgNO3 nos dio
positivo, por lo tanto
denotamos la presencia de
sales, que anteriormente
no había dentro del vaso de
bohemia. El ensayo de Biuret
nos dio negativo, lo que
quiere decir que no hay
proteínas en la muestra. Esto
prueba que las proteínas no
atravesaron la membrana
semi-permeable del
dializador.
Muestra dentro del dializador:
a) Biuret: POSITIVO
b) AgNO3: POSITIVO
Una vez obtenidos estos
datos, podemos afirmar que el
ensayo de AgNO3 dio positivo.
La concentración de sales de
la muestra bajó
considerablemente. Como ya
dijimos anteriormente, las
proteínas de la muestra no
pudieron atravesar la
membrana semi-permeable
del dializador, razón por la
cual el ensayo de Biuret
aplicado en esta muestra dio
positivo. La diálisis funcionó.

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