Este documento describe diferentes métodos microscópicos para observar microorganismos, incluyendo microscopía óptica, de contraste de fases, interferencia, campo oscuro, fluorescencia, luz ultravioleta, electrónica de transmisión y barrido. También explica técnicas de tinción diferencial, ácido-resistente y fluorescente que permiten mejorar el contraste y distinguir características celulares.

1.  Métodos Microscópicos
 Tinciones Diferenciales
 Tinciones Ácido-
Resistente
 Tinciones Fluorescentes
Presentado: Yohanna Adames

2. Métodos
Microscópicos
 MICROSCOPÍA ÓPTICA.
El microscopio óptico normal es un microscopio compuesto
que consta de una fuente luminosa, una lente condensadora de
la luz y dos juegos de lentes (oculares y objetivos) que
permiten la ampliación de la imagen.
Características
- Amplificación:
Producto del aumento individual
de los oculares y los objetivos.
- Resolución:
Espacio de máxima aproximación
entre dos puntos en el que aún
pueden observarse éstos como
entidades separadas. Determina
la máxima amplificación útil del
microscopio.

3. Observaciones de los microorganismos
Dos posibilidades:
• "In vivo“:
Indicada para observar
movimiento, inclusiones,
morfología, etc.
• Con tinción:
Aumenta el contraste entre el
objeto a observar y el medio
acuoso que lo
rodea.

4. Métodos
Microscópicos
 OTRAS MICROSCOPÍAS ÓPTICAS
• Las células tienen un índice de refracción más elevado que
el medio, lo que implica una alteración en la fase de la luz.
El contorno celular se observa con gran nitidez. Muy bueno
para observaciones in vivo, flagelos, entre otros.
Contrastes de
fases
• El microscopio de interferencia más empleado es el
microscopio de contraste diferencial de Nomarski. Es muy
útil para observaciones de células sin teñir pues produce
imágenes de alto contraste y gran relieve topográfico (casi
tridimensionales).
De
Interferencia
• El condensador normal es reemplazado por un
condensador de campo negro que no permite transmitir la
luz directamente a través del espécimen hacia el objetivo.
Contraste excelente.
De Campo
Oscuro

5. De Interferencia
De Campo Oscuro Contraste de Fases
Métodos
Microscópicos

6.  OTRAS MICROSCOPÍAS ÓPTICAS
• Utiliza luz de una longitud de onda tal que es capaz de
excitar alguna sustancia a fluorecer (emite luz de
diferente). Se utiliza para:
• - microorganismos que tienen fluorescencia natural:
metanobacterias (P420)
• - tinciones especiales: FISH, inmunofluorescencia
De
Fluorescencia
• Tiene un poder de resolución mayor, pues la longitud
de onda de la luz UV es menor que la de la luz visible
De Luz
Ultravioleta
Métodos
Microscópicos
No se observa directamente, si no por fotografías

7. Métodos
Microscópicos
De Fluorescencia De Luz Ultravioleta

8.  MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA
De
transmisión
Sustituyendo la fuente luminosa
por un haz electrónico y las
lentes por una serie de
electroimanes.
Para aumentar el contraste en
MET se utilizan tinciones con
sales de metales pesados de
elevada densidad electrónica.
Métodos
Microscópicos
De Barrido
Utiliza un haz de e- muy fino que
barre la superficie del
espécimen.
El haz electrónico primario
arranca e- de la superficie del
espécimen y los e- secundarios
son transmitidos a un colector,
amplificados y utilizados para
formar una imagen en una
pantalla de rayos catódicos.

9. Técnicas de Tinción.
Fundamento
El tamaño de la mayoría de las células bacterianas es tal, que resultan
difíciles de ver con el
microscopio óptico
Los colorantes pueden emplearse para:
Ejemplos de constituyentes celulares:
flagelos, esporas, cápsulas
paredes celulares, centros de
actividad respiratoria, etc.
- distinguir entre tipos de células
diferentes
- revelar la
presencia de determinados
constituyentes celulares
La principal dificultad es la falta de
contraste entre la célula y el medio
que la rodea
el medio más simple de aumentar el
contraste es la utilización de
colorantes

10. Técnicas de Tinción.
Fundamento
Fijación
Las células generalmente
son tratadas para
coagular el protoplasma
antes de teñirlas
Para bacterias
la fijación por el calor es
lo más corriente, aunque
también puede fijarse
con sustancias químicas
como formaldehido,
ácidos y alcoholes.
Si se añade colorante:
Después de la fijación, no
se producen cambios
estructurales en el
protoplasma

11. Los métodos de tinción son
de gran utilidad;
pero deben usarse siempre
con precaución, ya que
pueden conducir a errores
Las moléculas de colorante
forman en ocasiones
precipitados o agregados
que parecen estructuras
celulares auténticas,
Tales estructuras se
denominan artefactos,

12. Tipos de
Tinciones
•Tinción Diferencial
•Tinción Ácido
Resistente
•Tinción
Fluorescente

13.  Tinción Diferencial:
Si se desean observar
las características
morfológicas de las
bacterias
resulta sumamente
útil el utilizar las
preparaciones fijas y
teñidas
debido a que estas
permiten que las
células se visualicen
de mejor manera
y se puedan
diferenciar las
distintas especies por
su coloración
Pasos a seguir
para la tinción
de las bacterias
Realizar
el frote
La
fijación
Aplicar el
colorante
Grupos
Generales
Trifenil-metano
Oxacina
Tiacina

14.  Tinción Diferencial:
en general se utiliza la clasificación de acuerdo a su
carácter ácido – base.
Las tinciones diferenciales más
comúnmente utilizadas son:
Es decir: ácidos, bases o neutros, debido a que de
esto depende mucho su comportamiento
- Tinción de Gram
- Tinción de Ziehl-Neelsen
La coloración se da de acuerdo con:
- la acción de los iones complejos del colorante y
- los sitios activos de la superficie o del interior de la
célula.

15.  Tinción Ácido-Resistente:
La “ácido-resistencia" se refiere
a una propiedad física
específica de ciertas bacterias,
es decir, su capacidad de resistir
la decoloración del ácido
durante los procedimientos de
Hay tres tinciones tinción.
principales
que se utilizan con éxito con los
organismos acidorresistentes:
Estos organismos resistentes se
denominan  La tinción de "microorganismos
Ziehl-Neelsen
 El modo Kinyoun
ácido-resistentes", y sólo
 pueden Algunos ser tintes coloreados fluorescentes
para
fines de visualización utilizando
tinción ácidorresistente.

16.  Tinción Ácido-Resistente:
Tinción de Ziehl_Neelsen
Tinción bacteriológica especial que se utiliza para
ver microorganismos ácidorresistentes,
principalmente Mycobacteria.
Los organismos
acidorresistentes que se
tiñen con la tinción de
Ziehl-Neelsen se vuelven
de un color rojo brillante.
4. Haz una contra-tinción
con verde malaquita o
azul de metileno.
1. Cubre el
portaobjetos con
carbolfucsina, durante
3 a 5 minutos mientras
se calienta con vapor.
2. Decolora el
portaobjetos utilizando
una mezcla de etanol y
ácido clorhídrico.

17. Tinción de Kinyoun
Es similar a la tinción de Ziehl-Neelsen, con la
diferencia principal de que no se calienta la placa
4. Deja que se sequen al
aire antes de verlas.
3. Cubre las placas con
colorante azul de
metileno durante 3
minutos y enjuaga
suavemente con agua
hasta que salga clara.
1. Cubre las placas con
carbolfucsina Kinyoun
durante 5 minutos y
enjuágalas con agua
hasta que salga clara.
2. Cubre las placas con
ácido-alcohol – 3% de HCl
en etanol - durante 3
minutos y enjuaga con
agua hasta que salga clara.
 Tinción Ácido-Resistente:

18.  Tinción Ácido-Resistente:
• Tinción Fluorescente
Puede dar
lugar a
diferentes
tipos de
manchas
fluorescentes.
- Diferenciar
entre las
partes de una
célula
- Para aislar
ciertos
componentes
- Ver las
muestras con
mayor claridad

19. • Tinción Fluorescente
Tipos de manchas
fluorescentes
Hematoxilina que se
utiliza para aislar
los núcleos
Eosina que aísla el
resto de la célula
Fucsina , que tiñe el
colágeno o células
de músculo liso
Rodamina que aísla
proteínas
Malaquita verde,
para teñir las
bacterias y esporas.

20. CITAS BIBLIOGRÁFICAS
• Métodos en Microbiología II. Técnicas Microscopicas.J. L. Sanz. [Soporte:
en línea][28 de septiembre de 2014]. Disponible en:
http://www2.cbm.uam.es/jlsanz/docencia/archivos/03.pdf
• Tinción Diferencial. . [Soporte: en línea][28 de septiembre de 2014].
Disponible en: http://es.wikipedia.org/wiki/Tinci%C3%B3n_diferencial
• Tinciones Diferenciales. Prácticas de Laboratorio II. Dr. Magariños J., et
al. . [Soporte: en línea][28 de septiembre de 2014]. Disponible en:
http://es.slideshare.net/josemagarinos/tinciones-diferenciales-aspectos-
tecnicos?related=1
• Técnicas de Tinción. Fundamento. [Soporte: en línea][28 de septiembre
de 2014]. Disponible en: http://www.bio-nica.
info/biblioteca/TincionBacterias.pdf
• Tres tipos de tinción ácido-resistente. . [Soporte: en línea][28 de
septiembre de 2014]. Disponible en:
http://www.ehowenespanol.com/tres-tipos-tincion-acidoresistente-info_
242576/