El documento describe diferentes técnicas para el aislamiento y mantenimiento de cultivos puros de microorganismos en el laboratorio, incluyendo el uso de medios de cultivo selectivos, diferenciales y de mantenimiento. También explica métodos para preservar cultivos puros como la liofilización y almacenamiento a bajas temperaturas, y métodos de control microbiano como la aplicación de calor húmedo y seco para esterilizar materiales.

1. Técnicas de aislamiento Mantenimiento y
preservación de cultivos puros

2.  El cultivo puro representa las condiciones artificiales
para el desarrollo de las bacterias y otros
microorganismos y las condiciones impuestas a los
microorganismos mediante el manejo del
laboratorio.
 Para determinar las características de especies
concretas de microorganismos, es imperativo que el
organismo se aislé y se desarrolle en el laboratorio
como un cultivo libre de otras especies.

3.  ¿Qué condiciones requiere el crecimiento microbiano?
medio de cultivo: Una solución acuosa con los nutrientes y factores de
crecimiento necesarios.
Los μorganismos crecen en un
medio de cultivo artificial se
requieren condiciones como:
temperatura,
grado de humedad y
presión de oxígeno
asi como un grado correcto
de acidez o alcalinidad
.

4. CLASIFICACIÓN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO
Según su estado físico
Líquidos
Usualmente se denominan caldos ya que contienen los nutrientes
disueltos en agua. Permiten obtener suspensiones con un elevado
número de microorganismos. Ej. Caldo nutritivo.
Sólidos
Se pueden preparar a partir de medios líquidos a los cuales se les
añaden agentes solidificantes como agar, gelatina o sílica gel. Se
utilizan con frecuencia en el aislamiento y mantenimiento de los
microorganismos en el laboratorio. Ej. Agar nutritivo.

5.  Según la naturaleza de sus constituyentes
 Medios naturales o complejos (Indefinidos)
 Están constituidos por sustancias complejas de origen animal o vegetal y
usualmente se complementan con el añadido de minerales y otras
sustancias. No se conocen todos los componentes del medio de cultivo,
ni las cantidades exactas en que están presentes.
 Ej. Extracto de carne,
 extracto de levaduras.
 Medios sintéticos (químicamente definidos)
 Se preparan a partir de ingredientes químicamente puros y por lo tanto,
 Se puede conocer exactamente su composición cuali y cuantitativa.
 Por su costo sólo se emplean en procedimientos especiales.

6. E. coli
Medio definido Medio Complejo
K2HPO4 7 g Glucosa 15 g
KH2PO4 2 g Extracto de levadura 5 g
(NH4)2SO4 1 g Peptona 5 g
MgSO4 0.1 g K2HPO4 2 g
CaCl2 0.02 g Agua destilada 1000 ml
Glucosa 4-10 g pH 7
Elementos traza (Fe, Co,
Mn, Zn, Cu, Ni, Mo)
2-10 µg
Agua destilada 1000 ml
pH 7

7.  3. Según sus propósitos de uso
Medios de enriquecimiento
 Al cultivo en medio líquido que resulte en un incremento en
el número de un tipo dado de μorganismo en relación con el
número de otros tipos de μorganismos que puedan estar en
el inoculo.
 Puede contener sustancias que favorezcan el crecimiento del
μorganismo que nos interesa o que inhiban el crecimiento de
los otros tipos de microorganismos presentes.
 La selectividad de un cultivo de enriquecimiento no está
determinada únicamente por la composición química, sino
que puede ser variada significativamente modificando otros
factores tales como: temperatura, pH, fuerza iónica,
iluminación, aireación etc.

8.  Adición de sangre, suero o extracto de tejidos de animales y plantas.
Medios selectivos
 Se diferencian de los enriquecidos por ser medios sólidos y están
diseñados para el aislamiento de microorganismos específicos.
 Ej. CO2 como fuente de carbono es selectivo para autótrofos, la
adición de cristal violeta se inhibe el crecimiento de los Gram+,
utilizando maltosa como única fuente solo crecerán los que usen
maltosa.
Ej. Caldo tetrationato utilizado para el enriquecimiento
de las especies del género Salmonella provenientes de
muestras de heces, orina, agua o alimentos

9. Medios diferenciales
 Son aquellos destinados a facilitar la discriminación
de microorganismos de una mezcla por sus
propiedades diferenciales de crecimiento en dichos
medios.
 contienen indicadores de productos derivados de la
actividad metabólica de los μorganismos sobre
algunos de los componentes del medio.
Ej.: Agar base rojo fenol utilizado para detectar
fermentación de carbohidratos.

10. Medio de cultivo Tipo de medio
Agente
bacteriostático
Azúcar
fermentable
Sistema
Indicador
ALRF (agar
lactosa rojo fenol)
diferencial (no
selectivo)
----- lactosa rojo fenol
Agar Cetrimide selectivo
bromuro de
cetiltrimetil
amonio
------- --------
Agar Mac
Conkey
selectivo y
diferencial
cristal violeta,
sales biliares
lactosa rojo neutro
SS agar
(Salmonella
Shigella)
selectivo y
diferencial
verde brillante,
sales biliares
lactosa
rojo neutro,
citrato férrico
VRBA (violeta
rojo bilis agar)
selectivo y
diferencial
cristal violeta,
sales biliares
lactosa rojo neutro
Manitol Salt Agar
(Chapman)
selectivo y
diferencial
cloruro de sodio manitol rojo fenol
EMB agar (eosin
methylen blue)
selectivo y
diferencial
eosina y azul de
metileno
lactosa
eosina y azul de
metileno
XLD agar (xilosa
lisina
desoxicolato)
selectivo y
diferencial
desoxicolato de
sodio
lactosa,
xilosa,
sacarosa
rojo fenol, citrato
férrico amónico y
tiosulfato de
sodio
BiS agar (bismuto
sulfito)
selectivo y
diferencial
verde brillante,
sulfito de bismuto
glucosa
indicador de
sulfito de Bi y
sulfato ferroso
Baird Parker agar
selectivo y
diferencial
Cloruro de litio y
telurito de potasio
------
yema de huevo,
telurito de potasio
TSB + 10% NaCl
enriquecimiento
selectivo
cloruro de sodio ------ -------
Caldo
Tetrationato
enriquecimiento
selectivo
Tetrationato, sales
biliares
------ ------
CLBVB (caldo
lactosa bilis verde
brillante)
enriquecimiento
selectivo
verde brillante,
sales biliares
lactosa producción de gas

11.  Medios de mantenimiento
Suelen ser distintos a los de crecimiento óptimo ya
que el crecimiento y prolífico suele ocasionar la
muerte rápida de las células.
Ej. Añadir glucosa y utilizarla los microorganismos
producen ácidos, acidificándose el medio por lo
que es preferible no utilizar glucosa en los
medios de mantenimiento

12. • Métodos especiales de cultivo
Siembra en superficie sobre medio sólido
Siembra en profundidad (vertido en placa)
Dilución y solidificación en tubo
Cultivo en células vivas
Cultivo en animales Mycobacterium leprae
Importancia del cultivo de microorganismos:
•Obtención de cultivos puros.
•Análisis morfológico, fisiológico, genético y otras
características.
•Producción.
•Conteo de colonias (UFC)

13. Siembra por estrías
Dilución en serie

14. Técnica de las diluciones en serie
Dilución Tipo de microorganismo
10-1
a 10-3
Hongos
10-4
a 10-6
Levaduras
10-7
a 10-10
Bacterias
 Para el aislamiento de microorganismos se puede
aplicar la técnica de aislamiento por estría o por
extensión en superficie (se trasfiere de 0.1 a 0.5
ml.)

15.  Mantenimiento y preservación de cultivos puros.
- Resiembra periódica en medios frescos.
 Depende de el medio de cultivo
 Temperatura propia para mantener los cultivos
 El tiempo de resiembra.
- Preservación de cultivos con una capa de aceite
mineral.
 Para cultivos en agar inclinado el aceite deberá cubrir
mas o menos 1.5 cm. Del pico de flauta del agar
inclinado.

16. Mantenimiento y preservación de cultivos
puros.
- Liofilización. Proceso utilizado para la
eliminación de agua, mediante desecación al
vacío y a muy bajas temperaturas.
- Almacenamiento a temperaturas muy bajas
en presencia de agentes estabilizantes como
glicerol, dimetilsulfóxido, nitrógeno líquido
(-196ºC)

17. CONTROL
MICROBIANO

18. MÉTODOS DE CONTROL
Son técnicas para destruir microorganismos y se
dirige hacia la destrucción completa de
cualquier área donde puedan hacer daño.
MÉTODOS FÍSICOS
Y
MÉTODOS QUÍMICOS

19. ESTERILIZACIÓN MEDIANTE PRINCIPIOS FÍSICOS
 TEMPERATURA: Influyen directamente sobre el metabolismo celular, las
proteínas se desnaturalizan al romperse los enlaces de H y S en sus
estructuras secundarias y terciarias, bajo estas circunstancias se pierden
las actividades funcionales de dichas proteínas como la funcionalidad
enzimática .
Mesofílicas: 25ºC – 37ºC
Psicrofílicas: 4ºC – 10ºC
Termofílicas: 80ºC
Clostridium botulinum
endosporas
Clostridium tetani

20. La aplicación de calor representa uno de los
mecanismos más importantes para producir
esterilidad.
El ambiente es un factor importante para la
destrucción de μorganismos, el calor debe
alcanzar al μorganismos.
 Calor Húmedo: 1.- Desnaturalización de proteínas
2.- Oxidación de proteínas
 Calor Seco: 1.- desnaturalización de proteínas
2.- Daño oxidativo
3.- Efecto tóxico por alta
concentración de electrolitos.

21. Efecto del calor
 Daño en el inicio de la síntesis de proteínas.
 Salida de aa y de iones K+
 Autodegradación de ácidos nucleicos
 Daño en la membrana celular afectando el paso
de solutos al interior y la salida de estos.
 Daño en la respiración, el mecanismo reside en la
membrana.

22. Métodos por CALOR SECO:
 estufas de aire caliente. Estas constan de una doble
cámara, el aire caliente generado por una
resistencia eléctrica circula por la cavidad principal y
por el espacio entre ambas cámaras, a temperaturas
variables, entre 180ºC – 250ºC, ciclos de 1-2 h.
 Indicador Biológico: B. Subtilis var. Niger
 Tipo de material:
• Instrumental quirúrgico (metálico)
• Material de vidrio, porcelana y metal
• Polvos termoestables
• Grasas, aceites, parafinas, ceras....

23. Llama directa
 Consiste en colocar el material directamente al
fuego hasta que éste se ponga al rojo vivo. De
esta forma se queman los contaminantes hasta
reducirlos a cenizas.
 microbiología para esterilizar el asa
 con la llama del mechero.
.

24.  Incineración
El material a esterilizar se coloca en cámaras especiales
que alcanzan elevadas temperaturas. Con este
método se queman los contaminantes hasta reducirlos
a cenizas.
Es una forma efectiva de esterilizar el material
contaminado a descartar tales como
bolsas, papel, uniformes desechables, cadáveres de
animales,

25. CALOR HÚMEDO
 – Elementos autoclave El vapor bajo presión es el
agente de esterilización más eficiente
confinamiento de vapor en un recipiente cerrado, la
presión se eleva y la temperatura aumenta en forma
correspondiente. Con una presión de 1.05 Kg/cm3,
la temepartura del vapor alcanza 121ºC, con una
atmósfera libre de aire.
 Elementos del autoclave:
• Sistemas control de presión y válvulas
seguridad
• Llave de purga para eliminar el aire
Indicador Biológico:
Bacillus sterothermophillus

26. Ventajas
 Rápido calentamiento y penetración
 Destrucción de bacterias y esporas en corto tiempo
 No deja residuos tóxicos
 Hay un bajo deterioro del material expuesto
 Económico
Desventajas
 No permite esterilizar soluciones que formen
emulsiones con el agua
 Es corrosivo sobre ciertos instrumentos metálicos

27.  Agua en ebullición.
 El efecto letal aumentará si se le adiciona
carbonato de sodio al 2% o detergentes, las
esporas que son resistentes al agua en ebullición
x + de 2 h, pueden morir a 98ºC en 10 a 30 min.
En sol. De carbonato de sodio al 2%.

28. PASTEURIZACIÓN
 Pasteurización Lenta: 62.9ºC por 30 min., seguido
de un enfriamiento rápido a 4ºC.
 Pasteurización Rápida: 71.6ºC – 80ºC durante 15
segundos y rápidamente refrigerarla.
 Ultrapasteurización: 100 ºC durante fracciones de
segundos procediendo a la inmediata refrigeración.
 Principales μorganismos patógenos que provocan
tuberculosis, brucelosis, fiebre de tifoidea, difteria,
escarlatina y la fiebre Q, como la mayor parte de los
μorganismos que provocan que la leche se agrie.

29. Tyndalización:
 Esterilización por acción discontinua del vapor de agua, se basa en
el principio de Tyndall.
 Las bacterias que resisten una sesión de calefacción, hecha en
determinadas condiciones, pueden ser destruidas cuando la misma
operación se repite con intervalos separados y en varias sesiones.
Se efectúa por medio del autoclave de Chamberland, dejando
abierta la válvula de escape, o sea funcionando a la presión normal.
Puede también realizarse a temperaturas más bajas, 56º u 80º para
evitar la descomposición de las sustancias a esterilizar, por las
temperaturas elevadas.

30. FILTRACIÓN
 Este procedimiento es aplicable a la esterilización de
líquidos y gases, especialmente los primeros. Cuando el
líquido a filtrar no puede resistir, sin descomponerse , la
acción del calor, se aplica la técnica de filtración, la que
puede efectuarse mediante presión o aspiración.
 filtros de porcelana "de Chamberland" y los de tierras
infusorias calcinadas "Berkefield"
 Esponjas de asbesto “filtros de Sietz”
 Membrana de ester de celulosa de 8 – 0.25 μ
 Ej. Vacunas, cuantificación bacterias en agua y aire, separar
toxinas de las bacterias, antibióticos, proteínas, cateter,

31. RADIACIÓN
Como la transmisión de energía a través del espacio.
 Radiaciones ionizantes: ( rayos x, rayos gamma y rayos
catódicos) y rayos ultravioleta,
Ej. Artículos farmacéuticos, plásticos como cajas de petri,
jeringas, catéteres.
Rayos x para preservar frutas, vegetales y carne de cerdo.
 Luz ultravioleta, longitud de onda corta cubre un espectro
que va desde una manera parcial visible hasta una
totalmente obscura, longitud de onda desde 390 a 40 nm,
con un efecto letal máximo a 260 nm

32. MÉTODOS QUÍMICOS

33. AGENTES QUÍMICOS
 Son agentes que matan o inhiben el
crecimiento de los μorganismos.
 Antiséptico
 Desinfectante
 Conservadores

34. ANTISÉPTICO
 Agentes microbicidas que pueden aplicarse
sobre la piel y mucosas, pero no pueden
usarse internamente.

35. Desinfectantes
 Agentes que matan μorganismos pero no
necesariamente sus esporas y no deben
aplicarse sobre tejidos sino sobre objetos
inanimados como mesas, pisos, utensilios, etc.
Ejemplos: cloro, hipoclorito, compuestos clorados,
soda, sulfato de cobre, compuestos de amonio
cuaternario, etc.

36. Conservadores
 Agentes usados frecuentemente en
alimentos pero también en productos
farmacéuticos para inhibir el crecimiento de
μorganismos Por consiguiente al ser
ingeridos no deben ser tóxicos.
Ej: propionato de calcio, benzoato de sodio,
formaldehído, nitrato, dióxido de azufre.

37. Etanol (50-70%)Desnaturaliza proteínas y solubiliza
lípidos
Isopropanol (50-70%) Desnaturaliza proteínas y
solubiliza lípidos
Formaldehído (8%) Reacciona con grupos-NH2, -SH y
-COOH Desinfectante, mata endosporas
Cloro (Cl2) gas .Forma ácido hipocloroso (HClO), un
fuerte agente oxidante Desinfección en general y en
particular para agua potable
Detergentes (ej. amonios cuaternarios). Ruptura de
membranas celulares Desinfectantes y antiséptico
de piel

38. Conservadores
 Ácido propionico y propionatos0,32% Agente antifúngico en panes,
quesos
 Acido sórbico y sorbatos0,2% Agente antifúngico en quesos,
mermeladas, jugos
 Acido benzoico y benzoatos 0,1% Agente antifúngico en margarina,
sidra, bebidas gaseosas.
 Acido láctico variable Agente antimicrobiano en queso, manteca,
yogur.
 Dióxido de azufre, sulfitos 200-300 ppm Agente antimicrobiano en
frutas secas, uvas.
 Nitrito de sodio 200 ppm Agente antimicrobiano en alimentos
curados, pescado
 Cloruro de sodio variable Previene el deterioro microbiano en
carnes, pescado, etc.
 Azúcar variable Previene el deterioro microbiano en mermeladas,
jugos, jaleas, etc.

39. Agentes biológicos
 son sustancias sintéticas, semisintéticas o
producidas por μorganismos capaces de matar o
inhibir el desarrollo de otros μorganismos.
 Los agentes antivirales, antibacterianos y
antifúngicos, se definen como aquellos agentes
biológicos capaces de inactivar virus, bacterias y
hongos, respectivamente.

40.  pueden variar según la toxicidad selectiva que
presenten, los antibióticos no actúan de manera
similar en todos los tipos celulares -por el contrario-
presentan una toxicidad selectiva y según se trate
de una agente antifúngico o uno antibacteriano,
inactivará células fúngicas o bacterianas.
 Para el control de las enfermedades infecciosas en
plantas, animales y humanos es indispensable el
uso de antibióticos con la capacidad para inhibir las
bacterias u otros m.o. sin causar daño al huésped.

41. Mecanismos de acción
 1- Inhibición de la síntesis de peptidoglicano
 a- Antibióticos beta-lactámicos naturales y semisintéticos (penicilinas,
cefalosporinas, carbapenems, monobactam)
 b- Vancomicina (natural)
 c- Bacitracina (natural)
 2- Alteración de la membrana citoplasmática
 a- Polimixina B (natural)
b- Anfotericina B (natural)
c- Nistatina (natural)
d- Imidazoles (natural)
 3- Inhibición de la síntesis proteica
 Bloqueo de la transcripción (prevención de la síntesis de ARN)
 a- Rifampicina (natural)
b- Etambutol (no natural)
 Bloqueo de la traducción (alteración de ribosomas bacterianos)
 a- aminoglicósidos (natural)
b- tetraciclinas (natural)
c- Lincosamina y clindamicina (natural)
d- macrólidos (naturales y semisíntéticos)
 4- Interferencia con la síntesis de ADN
 a- Fluoroquinolonas (no natural, Ej: ciprofloxacina)
b- Sulfonamidas y trimetroprim (no naturales)