1. MEDICINA VETERINARIA UNIPAZ
MICROBIOLOGÍA GENERAL
Mic. Sandra Carolina Bermúdez
METODOS DE ESTERILIZACION Y PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO
OBJETIVOS
 Dar a conocer los parámetros de esterilización,
preparación y cuidado del material de vidrio para el
control sanitario de análisis microbiológico.
 Aprender las técnicas de preparación de diferentes
medios de cultivo, su esterilización y almacenamiento.
 Conocer las técnicas empleadas en Microbiología para el
cultivo y la manipulación de microorganismos en
condiciones de esterilidad.
MATERIALES Y EQUIPOS
 Cofia
 Tapabocas
 Guantesquirurgicos
 Bata de laboratorio
 Papel Kraft
 Algodón
 Gasa
 Cinta de enmascarar
 Tijeras
 Agua destilada – agua en bolsa
 2 erlenmeyer de 250 ml
 6 cajas de Petri
 6 tubos de ensayo
 6 Pipetas
 Mechero de alcohol
 Alcohol Antiséptico
 Medios de Cultivo
 Balanza
 Autoclave
 Horno
 Pipeteador
3. MARCO TEORICO
Las reacciones metabólicas de un organismo son el resultado
de la suma de todas las reacciones químicas y como estas
reacciones son influenciadas por la Temperatura, en
consecuencia el proceso vital también de ésta. Todos los
organismos dependen del agua, la mayor parte de su masa
es agua y todas sus actividades se realizan en ambientes
acuosos. Estos factores están íntimamente relacionados y se
les debe considerar de manera conjunta, al discutir los efectos
de las condiciones físicas sobre los microorganismos.
Los microorganismos se desarrollan bajo una amplia gama de
temperaturas, todos los organismos tienen su óptima mínima
y máxima temperatura de desarrollo. Las temperaturas
superiores a la máxima, generalmente inhibe su proliferación,
mientras que las temperaturas inferiores a la misma reducen
su metabolismo. Sin embargo la cantidad de agua en el medio
a cualquier temperatura, tiene efectos notables, para la
supervivencia microbiana.
Los métodos utilizados en el laboratorio de Microbiología
aplicando altas temperaturas son:
3.1CALOR AL ROJO
Los instrumentos tales como las asas y alambres de siembra
y varillas secas se esterilizan calentándolas en la llama del
mechero de Bunsen hasta que se ponen al rojo. Los
microincineradores se recomiendan para esterilizar asas de
inoculación contaminadas con material muy infeccioso, para
evitar el riesgo de chisporrotear partículas contaminadas
sobre el alrededor.
3.2 CALOR SECO
El calor seco destruye más lentamente las células vegetativas
ya que este las destruye al oxidar sus constituyentes
químicos. La esterilización con calor seco se recomienda
cuando no se desea que el vapor a presión tenga contacto
completo y directo con el material a esterilizar, como artículos
de vidrio, cajas de petri, pipetas, cápsulas etc.
Se aplica en un horno calentado eléctricamente que se
controla mediante termostatos y que está provisto de un gran
ventilador circulante que asegura la uniformidad de la
temperatura en todas las partes del contenido. Los equipos
modernos poseen controles electrónicos que pueden llevar la
temperatura al nivel requerido, mantenerla en ese punto
durante un tiempo establecido previamente y desconectar
seguidamente la corriente. En algunos modelos se incorpora
una cerradura solenoide para impedir que la estufa sea
abierta antes de que se complete el ciclo. Este dispositivo
salvaguarda y protege al personal de quemaduras.

2. El material que puede esterilizarse por este método incluye
placas de petri, matraces y pipetas de vidrio y objetos.
Pueden adquirirse de diversos proveedores cajas y cilindros
metálicos que almacenan convenientemente el material
durante la esterilización y lo conservan estéril hasta su
utilización.
Carga: El aire no es un buen conductor de calor, por lo que
las estufas deben cargarse sin apretar el contenido, de forma
que sean abundantes los espacios para permitir que circule el
agua caliente.
Tiempos y Temperatura de carga: Cuando se calculan los
tiempos de funcionamiento para el equipo de esterilización
por aire caliente, deben considerarse los siguientes períodos:
- El período de ascenso de la temperatura, que es el tiempo
necesario para que toda la carga alcance la temperatura de
esterilización, puede llevar alrededor de una hora.
- Los períodos de mantenimiento a las diferentes
temperaturas de esterilización recomendadas por el Medio
Councill que son 160ºC durante 45 minutos, 170ºC durante 18
minutos, 180ºC durante 7 ½ minutos y 1 ½ minutos.
- El período de enfriamiento, que se realiza gradualmente
para prevenir la rotura del material de vidrio comienza con un
descenso demasiado rápido de la temperatura. Este período
puede llevar 2 horas.
Control de los Esterilizadores de Aire Caliente
Los ensayos para los hornos de funcionamiento eléctrico
provistos de ventilador se describen en la Norma Británica
34212
El equipo de esterilización por aire caliente, debe calibrarse
con termopares cuando el aparato se instala y comprobarse
con termopares posteriormente cuando se considere
necesario.
El control de rutina ordinario puede efectuarse sencillamente
con la ayuda de los tubos de Browne. Los tubos de Browne
tipo 3 (punto verde) se utilizan para estufas provistas de
ventilador.
3.3CALOR HÚMEDO (VAPOR A PRESIÓN)
Se realiza mediante la esterilización en autoclave. Las
bacterias se matan más fácilmente por el calor húmedo (vapor
saturado) que por el calor seco. El vapor mata las bacterias
por desnaturalización de sus proteínas. El calor en la forma
de vapor a saturación y a presión proporciona temperaturas
superiores a las que se obtienen por la ebullición, además
tiene varias ventajas: calentamiento rápido, penetración y
humedad en abundancia, que facilitan la coagulación de las
proteínas. Una condición de seguridad convenida para la
esterilización es utilizar vapor a 121ºC durante 15 minutos.
Esta temperatura es adecuada para medios de cultivo, para
soluciones acuosas, tratamiento de cultivos y muestras
desechadas, etc.
El aire tiene una influencia importante en la eficacia de la
esterilización al vapor de agua, porque su presencia
modificala presión /temperatura. Por ejemplo: la temperatura
del vapor saturado a 1,054 kg/cm es 121ºC, siempre que se
haya eliminado todo el aire de la vasija, si sólo se ha
eliminado la mitad del aire, la temperatura de la mezcla aire-
vapor que resulta es determinada a la misma presión.
Además, la existencia de bolsas de aire impedirá la
penetración del vapor.
Debe eliminarse primero todo el aire que rodea y penetrar la
carga antes de que pueda comenzar la esterilización. Es
necesario recordar que algunos materiales no se deben
esterilizar en el autoclave. Sustancias que no se mezclan con
el agua, como grasa y aceites no pueden ser alcanzados por
el vapor, y así los organismos que los contienen sobrevivirán.
3.4 MEDIOS DE CULTIVO
El medio de cultivo constituye el aporte de nutrientes
indispensables para el crecimiento de los microorganismos.
La composición precisa dependerá de la especie que se
quiera cultivar, porque las necesidades nutricionales varían
considerablemente. Hay microorganismos muy poco
exigentes que crecen bien en medios de laboratorio normales
y microorganismos muy exigentes que necesitan
determinadas sustancias como vitaminas, suero o sangre
para crecer.
Existen medios cuya composición permite el crecimiento de:
1. un gran número de especies (agar nutritivo, caldo
ordinario, agar de Sabouraud),
2. determinados microorganismos (impidiendo el desarrollo
de otros), son los denominados medios selectivos.
3. Otros en cambio, se desarrollan para el estudio de
determinadas pruebas fisiológicas o test bioquímicos
(utilización de citratos, acidificación a partir de azúcares, etc.).
Los medios de cultivo poseen una serie de componentes:
1. Indispensables: Entre los primeros se incluye el agua,
nutrientes orgánicos (hidratos de carbono, aminoácidos,
vitaminas, etc) y nutrientes inorgánicos (P, Fe, N, Mg, S, etc)
2. Alternativos: sustancias isosmotizantes (NaCl), agente
solidificante (agar-agar), tampones, indicador de pH, etc

3. CLASIFICACIÓN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO
Los medios de cultivo se pueden clasificar de la siguiente
forma:
 Medios sólidos, contienen aproximadamente 1.5% o
más de agar (el cual les confiere la característica de
sólidos) se utilizan principalmente par el crecimiento y
aislamiento de bacterias.
 Medios líquidos, no contienen agar, se conocen también
como caldos, se utilizan para el crecimiento de inóculos
puros.
 Medios semisólidos, aunque en la naturaleza no existe
el estado físico de semisólido, en bacteriología se usa
para definir a aquellos medios que contienen agar pero
en proporción menos de 1.5% principalmente para
estudios de movilidad.
 Medios para crecimiento, son los que contienen
nutrientes que permiten el desarrollo de la mayoría de los
microorganismos no exigentes, con su velocidad de
crecimiento normal, y sin ofrecer a ninguna ventaja
especial. Ejm: agar nutritivo.
 Medios enriquecidos, son los medios a los que se
adiciona algunos componentes especiales con lo cual se
busca sólo el desarrollo de microorganismos exigentes.
 Medios selectivos, son aquellos a los que se les
incorpora un inhibidor del desarrollo bacteriano con lo
cual se busca sólo el desarrollo de un tipo especial de
bacterias.
 Medios indicadores, son todos aquellos en los cuales se
busca valorar características metabólicas especiales de
cada especie de bacteria.
3. 3 RECOMENDACIONES DURANTE EL PROCESO DE
PREPARACIÓN
 Cada ingrediente ó el medio deshidratado completo, se
debe disolver en un volumen adecuado de agua destilada
(las indicaciones se especifican en la etiqueta).
 Se determinará el pH del medio y si es necesario se
ajustará por medio de indicadores ó potenciómetro.
 El medio se depositará en recipientes adecuados, como
tubos, matraces, cuyas bocas se cierran con tapones de
algodón, plástico ó cubiertos de metal. La mayoría se
llevan a hervir con el objeto de que el objeto se disuelva
por completo.
 Los medios se esterilizan generalmente en autoclave.
Existen excepciones en las que se descomponen
sustancias de que consta el medio por el proceso del
autoclave.
 Los medios de cultivo deshidratados son higroscópicos y
la absorción de agua del exterior, así como la formación
de agua dentro de la botella como consecuencia de las
fluctuaciones de temperatura en el ambiente, favorecen
el crecimiento bacteriano. Esto puede conducir al
consumo de nutrientes, variaciones de pH y cambios en
el color del medio. Además la exposición a la luz puede
llevar a importantes alteraciones en los constituyentes del
medio de cultivo.
 El grado de disolución de un medio deshidratado, así
como la eficacia del mismo ya preparado, depende en
gran medida del procedimiento empleado en la
rehidratación. Se recomienda utilizar agua recién
destilada o completamente desmineralizada y un
erlenmeyer con capacidad del doble del medio que se
quiere preparar. Si el medio va a distribuirse en tubos,
debe agitarse constantemente para asegurar una
adecuada homogenización al momento de servirlos.
 Cuando se va a esterilizar, debe asegurarse en seguir las
instrucciones de tiempo, presión y temperatura para la
obtención de medios de cultivo óptimos. Una temperatura
de 121 °C, presión de 15 libras y un tiempo de
esterilización de 15 minutos, son suficientes para la
mayoría de los medios.
 El medio esterilizado debe ser enfriado a 45°-60°C en un
baño maría, para evitar la formación de agua de
condensación. Al ser vertidos en las placas Petri, evitar la
formación de burbujas y coágulos. Durante el proceso de
servida, debe tomarse una muestra del medio para
realizar el control de calidad por esterilidad y eficiencia.
4. METODOLOGÍA
4.1 ESTERILIZACION MATERIAL DE VIDRIO
Esterilización de caja petri
 Se coloca la caja petri en el centro del papel estraza
y se dobla cubriéndola con dos de sus extremos
(frente y posterior), de tal manera que parezca un
rectángulo con unas pequeñas salientes en la parte
superior.
 Con las salientes del papel estraza hacer tres
dobleces.
 Alizar los extremos del papel (lados "laterales" del
rectángulo).

4.  Doblar las cuatro esquinas que forman el rectángulo
hacia el centro de tal manera que queden dos
puntas.
 Estas doblarlas hacia abajo.
Esterilización de pipetas
 Colocar la pipeta aproximadamente a 45º sobre el
papel estraza, cuidando que la punta quede cerca de
uno de los extremos.
 Doblar la esquina en la que no estáapoyada la
pipeta, de tal manera que la punta de esta quede
cubierta.
 Nuevamente doblar la esquina en la que no se
encuentra la pipeta para que esta tenga doble
protección.
 Enrollar la pipeta con el demás papel estraza.
 Al terminar de enrollar doblar la parte final del papel
hacia abajo.
Gorro protector de matraz
 Doblar el papel estraza por la mitad.
 Doblar las dos puntas que hayan quedado unidas
por el papel hacia adentro.
 Doblar una cuarta parte (de la mitad del papel que
quedo en la parte superior) del papel estraza hacia
arriba.
 Dividir la figura( la que se está armando con el papel
estraza) en tres partes a lo largo, las esquinas de
esta doblarlas hacia atrás.
 Doblar el otro pedazo de papel (la mitad del papel
que quedo en la parte inferior) que no se doblo hacia
atrás
4.2 PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO
Cada grupo de trabajo se encargará de la preparación de una
cantidad suficiente de un determinado medio de cultivo, para
ser utilizado, en su momento, por todos los alumnos del grupo
de prácticas. Las instrucciones a seguir dependerán del
número de mesa y el medio de cultivo asignado, pero en
todos los casos, los pasos son los siguientes:
En la preparación de medios de cultivo se deben seguir los
siguientes pasos:
1. Realice el cálculo correspondiente para la preparación
del medio de acuerdo con la formulación establecida para
cada medio de cultivo.
2. Mida el volumen de agua destilada según sus cálculos.
3. Teniendo en cuenta el volumen de agua que se debe
utilizar.
4. Pese la cantidad del medio necesaria de acuerdo a los
cálculos.
5. Mezcle el polvo con la cantidad de agua medida
anteriormente.
6. Homogenice la solución.
7. Lleve a hervir hasta que el medio se torne translúcido
8. Esterilizar en el autoclave a 120 libras de presión por 15
minutos.
9. Sirva el medio según corresponda: en cajas de petri 20
mililitros, en tubos de ensayo 5-8 mililitros, etc.
CONSULTA
Mencione en cada ítem los parámetros más importantes que
se consideran en cada caso.
1. Pruebas básicas de control de calidad de medios
preparados
2. Criterios de calidad de los medios preparados
3. Fallas y causas en la preparación de medios de cultivo