Este documento describe diversas pruebas para evaluar la capacidad degradadora de macromoléculas por parte de bacterias mediante enzimas extracelulares. Explica los fundamentos de pruebas como la licuefacción de gelatina, hidrólisis del almidón y caseína, y la hidrólisis de fosfolípidos y eritrocitos. El objetivo es entender y realizar ensayos de degradación de polímeros por enzimas microbianas para identificar bacterias como Escherichia coli y Pseudomonas aeruginosa.

1. Instituto Politécnico Nacional.
Escuela Nacional de Ciencias
Biológicas.
Microbiología General.
SEMINARIO: DIGESTIÓN DE
MACROMOLÉCULAS.

2. INTRODUCCIÓN.
 Para que una célula crezca, debe
satisfacer todos su requerimientos
nutricionales a partir del medio que las
rodea.
 Las fuentes a partir de las cuales las
células satisfacen algunos de estos
requerimientos, permiten clasificarlas
fisiológicamente.

3. Requerimientos nutricionales y clasificación fisiológica.
Fuente de: Proceso fisiológico:
Energía.
Física (luz). Fototrofía.
Química. Quimiotrofía.
Carbono.
Únicamente CO₂. Autotrofía.
Orgánico. Heterotrofía.
Donador inicial de
electrones.
Inorgánico. Litotrofía.
Orgánico. Organotrofía.
Aceptor final de
electrones.
Orgánico. Fermentación.
Inorgánico. Respiración
anaerobia.
O₂. Respiración aerobia.
CO₂. Autotrofía,
fotosíntesis,
metanogénesis.

4.  Los sustratos poliméricos son tan
grandes que los MO’s no pueden
incorporarlos a su interior, por eso, los
degradan con enzimas
despolimerizantes extracelulares.

5. Polímeros biológicos y enzimas
despolimerizantes.
Polímeros. Enzimas.
Polisacáridos. Glicosidasas.
Proteínas. Proteinasas,
proteasas.
Lípidos. Lipasas
Esterasas.
Fosfolípidos Fosfolípasas
Ácidos nucleicos. Nucleasas.

6. OBJETIVO.
 Entender y montar ensayos de
degradación de polímeros por enzimas
extracelulares microbianas.
CEPAS UTILIZADAS
 Escherichia coli, Bacillus megaterium,
Pseudomonas aeruginosa, Salmonella
typhi, Proteus vulgaris, Klebsiella
pneumoniae, Shigella flexneri,
Staphylocuccus aureus.

7. PRUEBA DE
LICUEFACCIÓN DE LA
GELATINA EN TUBO.

8. FUNDAMENTO.
 Se incorpora gelatina a diversos medios
para determinar la capacidad de un
organismo de producir enzimas de tipo
proteolítico, que son capaces de la
gelatinólisis (gelatinasas).
 Son detectadas por la digestión o
licuefacción de la gelatina.

9. FUNDAMENTO.
 El catabolismo de las proteínas por las
gelatinasas es un proceso en dos
etapas, que da como resultado final una
mezcla de aminoácidos individuales.
 Proteína+HOH polipéptidos.
 Polipéptidos+HOH aminoácidos
individuales.
(glicina, prolina e
hidroxiprolina).
Gelatinasas.
Proteinasas.
Gelatinasas.
Peptidasas.

10. COMPOSICIÓN DEL MEDIO DE
CULTIVO.
 Caldo nutritivo deshidratado.
 Gelatina.
 pH= 7.0.

11. PROCEDIMIENTO.
Sembrar por picadura (3- 4
asadas)
• Incubar a 37°C por 24- 48
horas.
• Pasar los tubos a 4°C o a
un baño de hielo (1
hora).
PRUEBA
POSITIVA (+).
Contenido del
tubo permanece
PRUEBA NEGATIVA (-).
Si el contenido del tubo
solidifica.

12. INTERPRETACIÓN DE
RESULTADOS.
PRUEBA NEGATIVA (-).PRUEBA POSITIVA (+).

13. HIDRÓLISIS DEL
ALMIDÓN.

14. AGAR ALMIDÓN.
 Composición:
 Caldo nutritivo deshidratado
 Almidón soluble
Agar
Agua
pH: 6.8 – 7.2

15. FUNDAMENTO.
La molécula del almidón (amilosa lineal y
amilopectina ramificada) debe descomponerse en
sustancias más simples y fáciles de asimilar.
Es utilizado para identificar microorganismos
productores de enzimas amilasas, las cuales
hidrolizan el almidón (enlace 1,4 α D - glucanos) con
formación de maltosa.
Almidón
Amilasa
+ H₂O

16. Hidrólisis del almidón.
Incubar cultivos
a 37°C durante
48 hrs.
Añadir Lugol
El yodo (yodato- yoduro)
se une a los enlaces α- 1,
4 del almidón generando
una coloración azul negro,
mientras que los sitios
donde hay hidrólisis
permanecen incoloras.
Hidrolisis
positiva: si al
añadir lugol se
observan halos
transparentes
que rodean a las
bacterias.

17. HIDRÓLISIS DELA
CASEÍNA EN CAJA.

18. AGAR LECHE
DESCREMADA.
 Composición:
 Caldo nutritivo deshidratado
 Leche descremada en polvo
 Agar
Agua
pH= 7.2

19. FUNDAMENTO.
Caseína
Se utiliza para la demostración de la hidrólisis de la
caseína por microorganismos aerobios. La Caseínasa
(proteasa) es excretada al medio para la degradación de
proteínas, la caseína es la proteína de la leche que le
confiere el color blanco (formación de micelas); cuando la
caseína es hidrolizada desaparece el color blanco
alrededor del crecimiento microbiano.
Caseínasa
Treonina
Aminoácidos como:
+ H₂O

20. HIDRÓLISIS DE CASEÍNA:
Incubar de 28-
30 °C durante 48
hrs.
Hidrólisis positiva: si
presenta halos
transparentes alrededor
de las colonias.

21. HIDRÓLISIS DE
FOSFOLÍPIDOS
(GELOSA SANGRE Y AGAR
BAIRD- PARKER).

22. AGAR BAIRD – PARKER
(AGAR YEMA DE HUEVO).
 Composición:
 Triptona
 Extracto de carne
 Extracto de levadura
 Glicina
 Yema de Huevo emulsionada
 Piruvato de sodio
 Cloruro de Litio
 Telurito de Potasio 1%
 Agar
 Agua
 pH = 7.0

23. AGAR YEMA DE HUEVO.
Aislamiento de Staphylococcus aureus.
La glicina, el cloruro de litio y el telurio
potásico actúan como agentes
selectivos. La yema de huevo es el
sustrato para determinar la producción
de lecitinasa y la actividad de la lipasa.
K₂TeO₃
Telurito de Potasio.
Te
Telurio.

24. HIDROLISIS DE FOSFOLÍPIDOS.
Agar Baird Parker
Incubar a 37 °
C durante 48
hrs.
Baird Parker.
Zona opalescente en el
agar en torno a la colonia,
indica hidrolisis de
fosfolípidos.

25. GELOSA SANGRE.
 Composición:
 Infusión de corazón de ternera
 Sangre
 Triptona
 Cloruro de sodio
 Agar
 Agua
 pH= 6.8

26. HEMÓLISIS.
 Algunas bacterias producen enzimas
extracelulares hemolisinas S y O que
hidrolizan la membrana celular de los
eritrocitos.
 Hemolisis α: hidrolisis de los enlaces éster-
fosfato con acumulación intracelular de
diglicéridos insolubles.
 Hemolisis β: lisis completa de los
eritrocitos, debido a la hidrólisis de los
enlaces éster y la utilización de los
productos de los ac. Grasos por los m.o.
 Hemolisis γ: MO no sintetiza hemolisinas.

27. HIDRÓLISIS DE
FOSFOLÍPIDOS.Gelosa
sangre.
Hemólisis α:
Presencia de halo
verdoso, opaco
alrededor de la
colonia.
Hemólisis β:
Halo
totalmente
transparente
alrededor de la
colonia.
Hemólisis γ:
Sin presencia de
Halo.

28. PRUEBA DE LA
LECHE CON
TORNASOL.

29. FUNDAMENTO.
 La leche (caseína, lactalbúmina y
lactoglobulina) tornasolada es un medio
deferencial que se emplea para
determinar varias funciones metabólicas
de un organismo.
 Fermentación de la lactosa.
 Acidificación
 Reducción del tornasol.
 coagulación
 Peptonización (digestión).
 Alcalinización
 Formación de gas.

30. FERMENTACIÓN DE LA
LACTOSA.
 Lactosa glucosa+ galactosa.
 Glucosa+
ácido pirúvico.
Ácido láctico.
Ácido butírico.
CO₂ + H₂.

31. Interpretación
Testigo (color azul purpura) No inoculado. pH 6.8
Color rojo, rosado Reacción ácida por fermentación de
lactosa. pH 4.5
Azul purpura No fermenta lactosa.
Azul Reacción alcalina. No fermenta
lactosa, el m.o utiliza sustancias
nitrogenadas liberando amoniaco. pH
8.3
Blanco Reducción de tornasol a una
leucobase.
Formación de coagulo (renina) Coagulación de la caseína.

32. FORMACIÓN DE COÁGULO
 Las enzimas proteolíticas provocan la
hidrólisis de las proteínas de la leche,
lo que resulta su coagulación.
 El coágulo es causado por una
precipitación de la caseína por la
formación de ácidos o por la
conversión de la caseína en
paracaseína por la enzima renina.

33. FORMACIÓN DE UN
COÁGULO ÁCIDO.
 Lactosa ácido láctico.
 Ácido láctico + caseinato de Ca
caseinógeno (pp insoluble).
 La precipitación de la caseína provocada por los
ácidos orgánicos a partir de la lactosa en
condiciones ácidas, produce un coágulo firme,
gelatinoso que no se separa de las paredes del
tubo.
Caseasa.

34. PEPTONIZACIÓN.
 La hidrólisis de la caseína por la
actividad enzimática produce una
conversión final del precipitado
caseinógeno en un líquido claro.
 Sólo se produce cuando la bacteria
contiene la enzima proteolítica
caseasa.

35. FORMACIÓN DE GAS.
 Los gases (CO₂ y H₂) pueden
formarse como resultado final de la
fermentación de la lactosa. Se
produce una fermentación turbulenta
cuando hay abundancia de gases que
descomponen un coágulo ácido.

36. COMPOSICIÓN DEL MEDIO DE
CULTIVO.
 Leche descremada en polvo.
 Tornasol en polvo.
 pH= 6.8.

37. PROCEDIMIENTO.
Inocular los tubos con la
leche tornasolada.
•Incubar los tubos a 37°C por 24
horas.
Acidificación. Coagulación.
Reducción Peptonización Alcalinizaci
ón

38. INTERPRETACIÓN DE
RESULTADOS.
ACIDIFICACIÓN. COAGULACIÓN.
 Cepa: Escherichia
coli.
 Cepa: Pseudomonas
aeruginosa.

39. INTERPRETACIÓN DE
RESULTADOS.
REDUCCIÓN. PEPTONIZACIÓN.
 Cepa: Shigella flexneri.  Cepa: Pseudomonas
aeruginosa.

40. INTERPRETACIÓN DE
RESULTADOS.
ALCALINIZACIÓN. TUBO TESTIGO.
 Cepa: Pseudomonas
aeruginosa.

41. RESULTADOS

42. CUESTIONARIO:
1.- Explicar términos:
Factor de crecimiento: Sustancias capaces de sustituir
deficiencias metabólicas, que favorecen el crecimiento
Requerimiento nutricional: necesidades de los organismos
para su óptimo crecimiento, mantenimiento y funcionamiento
Autotrófico: organismos que tienen la capacidad de elaborar
su propio alimento a partir de sustancias inorgánicas como: luz
y CO₂.
Heterotrófico: m.o que satisfacen sus requerimientos de
energía (orgánica) donador inicial de electrones y carbono a
partir de una misma molécula orgánica como azúcares o
aminoácidos.
2.- ¿Qué significa literalmente el término hidrolítico?
Destrucción, descomposición o alteración de una sustancia
química (enlaces químicos entre las moléculas) por el agua.
3.- Las enzimas extracelulares que rompen proteínas se
llaman _Proteasas_, las que rompen polisacáridos

43. 4.- conteste F o V a las siguientes aseveraciones.
(F) Muchas enzimas extracelulares son hidrolíticas, pero no
todas las enzimas hidrolíticas son extracelulares.
(F) Las peptidasas son enzimas extracelulares que
hidrolizan proteínas de alto peso molecular.
(F) Las glicosidasas hidrolizan enlaces éster en
polisacáridos.
(V) Las membranas biológicas son sensibles a lipasas.
5.- Un ejemplo de polisacárido estructural es _celulosa_. Un
ejemplo de polisacárido nutricional es_ almidón_.

44. 6.- La caseína es una proteína de origen _animal_, y la
gelatina es de origen _Animal_.
7.- La descomposición de los alimentos por triglicéridos
provoca _rancidez_.

45. BIBLIOGRAFÍA.
 Mac Faddin, J. F. 1984. Pruebas
Bioquímicas para la identificación de
bacterias de importancia clínica.
Medica Panamericana, México.
 Gutiérrez, E. 2017. Medios de cultivo,
tinciones y pruebas bioquímicas. 1ª.
Edición.