Este documento describe métodos para el aislamiento y recuento de bacterias anaerobias, incluyendo la eliminación del oxígeno en medios de cultivo, el uso de la jarra de anaerobiosis, y técnicas como el número más probable para estimar la cantidad de bacterias en una muestra. También presenta protocolos para comparar el crecimiento de Clostridium spp., E. coli y B. subtilis en medios con diferentes potenciales redox.

1. Aislamiento y recuento de
bacterias anaerobias
Grupo: 3QV2 Equipo: 4 Laboratorio: 4

3. • Métodos para eliminar el oxígeno de un medio:
• Adición de sustancias reductoras (Cys y tioglicolato de sodio)
• Uso de tapones (rosca, aceite mineral o vaselina)
• Calentamiento del medio
• Remoción de oxígeno por reacciones químicas (sistema Gas Pak)
• Sustitución de oxígeno por otros gases (H2, N2, o CO2)
• Tubos de 150mm llenos a ¾.

4. • Actualmente uno de los sistemas más
confiables para el manejo de
microorganismos anaerobios estrictos
es la jarra de anaerobiosis en la cual
se elimina el contenido de oxígeno
por medio de reacciones químicas.

5. Introducción
NaBH4 + 2 H2O NaBO2 + 4 H2
C3H5O(COOH)3 + 2 NaHCO3 C3H5O(COONa)3 + 3 CO2 + 3 H2
2 H2 + O2 2 H2O
Pd
CoCl2

6. Introducción
• Los microorganismos anaerobios degradan materia orgánica
compleja en el ambiente.
• Se encuentran en el tracto intestinal de los animales.
• Responsables de varias infecciones (Clostridium tetani, Clostridium
perfringes, Clostridium botulinum)
• Se determinan en una muestra por el método estadístico de Número
Más Probable (NMP)

8. • Tubos de 16 x 150 mm con tapón de rosca con 18 mL de : caldo
tioglicolato, caldo carne cocida con sello de aceite mineral, caldo
nutritivo
• Tubos de 16 x 150 mm con tapón de rosca con 10 mL de leche-fierro
• Tubos de 16 x 150 mm con tapón de rosca con 9 mL de agua destilada
estéril
• Pipetas estériles
• Caja petri con agar: gelosa sangre, tripticasa-sulfato de Neomicina y
sulfato de Polimixina (TSN) o tioglicolato.
• Jarra de anaerobiosis con sistema generador GasPak o Anaerogen.
• Muestras de materia fecal de herbívoro.
• Cepas de: Escherichia coli, Bacillus subtilis y Clostridium sp.

9. Métodos
Adicionar 1g
de muestra al
tubo con 9mL
de agua
destilada
Homogeneizar
y dejar
sedimentar
Tomar una asada
del sobrenadante
y sembrar por
estría cruzada en
agar tioglicolato o
TSN
Homogeneizar el
tubo nuevamente
y calentar en baño
de agua a
ebullición por 5
minutos
Dejar enfriar,
sedimentar y
sembrar como
anteriormente.
Colocar las placas
inoculadas en
jarra de
anaerobiosis.
Incubar a 37°C
durante 48 horas
I. Aislamiento de bacterias anaerobias de suelo o materia fecal

10. • II. Cultivo en la jarra de anaerobiosis. (Sistema GasPak)
Colocar 1 gota
del cultivo de
Clostridium sp.
En dos placas de
gelosa angre y
en dos de agar
TSN o
tioglicolato
Aislar por estría
cruzada
Colocar una
placa de gelosa
sangre y una de
TSN o agar
tioglicolato en
jara de
anaerobiosis
Iniciar la reacción
del sistema
GasPak y
colocar el
indicador redox
en una de las
paredes de la
jarra.
Incubar en
condiciones
aeróbicas las
placas restantes
(testigos)
Incubar a 37°C
por 48 hrs
Realizar frotis de
las colonias y
teñir por Gram

11. • III. Estimación de Clostridium sp. En una muestra de suelo o materia fecal por el NMP
Hacer una serie
de diluciones
decimales de la
muestra hasta
10-3
Sembrar por
triplicado 1mL de
cada dilución en
tubos con 10mL de
leche-fiero con
sello de aceite
mineral
Incubar a 43°C
durante 18-24 hrs.
Tubos con
fermentación
tormentosa son
positivos
Estimar el NMP/g
en la muestra
original utilizando
la tabla del
manual.

12. • IV. Comparación del crecimiento en medios líquidos de diferente potencial redox de
Clostridium sp., Escherichia coli y Bacillus subtilis.
Con pipeta estéril
inocular cada
cepa en el fondo
de tubos de
caldo tioglicolato,
carne y nutritivo
Incubar a 37°C
durante 24-48
horas
Observar el
crecimiento y
localización del
crecimiento en
los diferentes
medios de cultivo
Anotar en los
dibujos de los
medios líquidos la
posición donde
crecieron las sepas

13. Característica Colonia 1 Colonia 2
Medio de cultivo Gelosa sangre Tioglicolato
Forma Amiboide Rizoide
Tamaño 4mm 2 mm
Color Blanco nacarado Blanco hueso
Borde Entero Crenado
Superficie Lisa Arborescente
Elevación Plana convexa Plana
Luz transmitida Translucida Translucida
Luz reflejada brillante Brillante
Aspecto Húmedo Humedo
Consistencia Mucoide Mucoide
Acción sobre el medio Hemolisis ------
1: Morfología colonial de la muestra fecal incubada en jarra de
anaerobiosis
Clostridium sp

14. • Describir la morfología microscópica de las colonias aisladas de la
muestra fecal de la muestra y la de Clostridium sp
Clostridium sp
Característica Colonia Colonia 2
Clostridium sp
Forma Bacilo largo Bacilo grande
Agrupación Diplobacilos Diplobacilos
Tinción Gram Gram positivo Gram positivo
Presencia de
endosporas
(--) (+)

15. EL NUMERO MAS PROBABLE
DILUCION NUMERO DE TUBOS
POSITIVOS
NMP/ ml o g
10−1 0
10−2 0 < 3
10−3 0

16. Hacer los esquemas de los crecimientos en los tres medios
E. coli
(Anaerobio facultativo)

17. Bacillus subtilis
(aerobio estricto )

18. Clostridium sp
(anaerobio estricto)

19. 6: mencione 5 ambientes donde se encuentren los anaerobios:
• Alimentos enlatados
• Cavidad bucal (molares)
• Conductos del aparato digestivo
• Conductos del aparto urinario
• Digestores de aguas residuales
• Sedimentos anoxicos
7: reacciones sobre el gas pack

20. 8: ¿porque un microorganismo facultativo puede crecer en ambientes
oxidantes o reducidos?
9: como se produce las condiciones anaeróbicas en el medio leche –
fierro?