La RT-PCR es una variante de la PCR que utiliza mRNA en lugar de DNA como molde para la amplificación. El proceso implica una retrotranscripción del mRNA a cDNA seguida de la amplificación por PCR estándar. La RT-PCR se usa principalmente para el estudio de retrovirus y la detección de expresión génica.

1. RT-PCR
Protocolo, aplicaciones y análisis de resultados
Por: Enrique Pérez
Agustín Torres

2. ¿Qué es?
 Es una variante de la PCR que usa como molde un mRNA en lugar de
un dúplex de DNA.
 En ambos casos el producto es un gran numero de moléculas de DNA.
 Además, por lo expresado anteriormente se sobreentiende que es
necesario una retrotranscriptasa para poder formar DNA a partir de
mRNA.
RT-PCR

3. Protocolo
 Síntesis previa de cDNA
 PCR amplificación

4. Síntesis previa de cDNA

5. Materiales
 Buffers
 Rnase free ddH2O
 RT-PCR buffer
 Enzimas y buffers de enzimas
 MMLV reverse transcriptase
 SUPERaseIN Rnase inhibitor
 Ácidos nucleicos y oligonucleótidos
 dNTP´s
 Primers
 mRNA
 Additional ítems
 Tubos de PCR

6. Método
 Agregar de 2 µl a 50 µl de primers aleatorios en tubos de pared
delgada (un tubo por reacción)
 Agregar hasta 2.5 µg del total de RNA.
 Añadir 4µl de dNTP.
 Aforar hasta 16 µl con Rnase free H2O.
 Aplicar calor hasta llegar a 70 °C por 10 minutos para desnaturalizar
la estructura secundaria del mRNAy después colocar inmediatamente
en hielo.

7.  Agregar 2 µl de 10x RT-PCR buffer
 Agregar 1 µl de SUPERaseIN (20 unidades/µl)
 Agregar 1 µl de MMLV retrotranscriptasa (100-200 unidades/µl)
 Incubar a 42°C por una hora
 Inactivar la retrotranscriptasa por calentamiento a 95°C por 10 minutos
 Se procede a continuar con la etapa de amplificación por PCR.

8. Amplificación por PCR

9. PCR
 Primero debemos saber que el ultimo paso que seguimos fue el de la
inactivación de la retrotranscriptasa por calentamiento.
 Recordemos que tenemos el cDNA hebra sencilla el cual servirá de
molde para formar un DNA dúplex.
 Para formar el dúplex solo se tienen que seguir los pasos de la PCR
clásica desde el punto donde el DNA esta desnaturalizado.
 Después de ello, se prosigue a hacer los ciclos necesarios de la PCR
estándar.

10. Análisis de resultados
Electroforesis

11. Los productos de reacción son analizados usualmente por electroforesis en gel
de agarosa. El gel se tiñe con bromuro de etidio. Los geles de agarosa para
analizar los productos de cDNA de la RT-PCR no nos permite la cuantificación
ya que el bromuro de etidio es muy insensible y cuando una banda es
perceptible sobrepasa la etapa logarítmica de amplificación.

12. Aplicaciones

13. Secuenciación y estudio de retrovirus
 Estos virus presentan su material genético en
forma de RNA y, como su nombre lo indica,
necesitan de una retrotranscriptasa para
convertirlo a DNA y que el genoma del
huésped lo exprese.
 Por poseer un genoma de RNA se requiere
esta variación de la PCR para el estudio de
estos tipos de virus.

14. Otras aplicaciones
 Identificación de células tumorales.
 Mecanismos inmunológicos y de inflamación.
 Análisis citogenético molecular de translocaciones
cromosómicas
 Expresión proteica de antígeno específico
prostático en células.
 Translocaciones en los tumores de piel y partes
blandas.

15. Citas bibliográficas
 Castro Morillo, A. diciembre de 1999. TÉCNICAS DE BIOLOGÍA MOLECULAR EN
El DIAGNÓSTICO EN DERMATOLOGÍA. Variantes de la PCR. Consultado el
13 de noviembre de 2015 de la página
http://sisbib.unmsm.edu.pe/bvrevistas/dermatologia/v09_sup1/tecnicas_2
.htm
 Cortazar, A. Silva, P. Junio 2014. Métodos físico-químicos en
biotecnología. RT-PCR. Universidad Autónoma de México. Tomada de
http://www.ibt.unam.mx/computo/pdfs/met/pcr.pdf el 13 de noviembre
de 2014.}
 Dieffenbach, C. W. ; Dveksler, G. S. (2003) PCR Primer: a laboratory manual.
(2da ed.) Cold Spring Harbor Laboratory Press.