Este documento describe diferentes tipos de microscopios utilizados en microbiología. Explica que los microscopios ópticos actuales son descendientes de los microscopios compuestos del pasado. También describe los factores que afectan la calidad de imagen como aumento, contraste y resolución. Además, detalla los principios de funcionamiento de microscopios de campo claro, campo oscuro, fluorescencia, contraste de fases y Nomarsky. Por último, explica que los microscopios electrónicos mejoran la resolución hasta 1000 veces más que los óptic

1. 2°ENFERMERÍA
MICROBIOLOGÍA Y PARASITOLOGÍA
PROFESORA: PATRICIA NARBÓN

2.  Estudios de microbiología han estado muy
ligados al microscopio.
 Poder de resolución ojo humano: 100µm
 Poder de resolución del mejor microscopio
óptico: 0,2µm. 500 veces superior al ojo
humano.
 Diferenciar entre aumento y resolución

5.  El poder de resolución es la capacidad de
mostrar distintos y separados dos puntos muy
cercanos.
 Cuanto mayor sea el poder de resolución,
mayor será la definición del objeto.
 La resolución es inversamente proporcional a
la distancia mínima a la cual se pueden
distinguir dos puntos muy cercanos.

6.  Los microscopios que utilizamos en la actualidad son
los descendientes de los microscopios compuestos
que ya se conocían en la época de Leeuwenhoek. Los
microscopios compuestos de aquella época utilizaban
varias lentes con lo que se conseguían mayores
aumentos que con el microscopio simple.
 La mejoría de los microscopios actuales básicamente
ha consistido en incorporar lentes correctoras que
permiten una mejor iluminación de toda la imagen y
evitan las aberraciones cromáticas propias de las
lentes simples. Los microscopios modernos
llevan tres SISTEMAS DE LENTES el
Condensador, el Objetivo y el Ocular

8. La calidad de la imagen depende
de tres factores:
 Aumento
 Contraste
 Resolución

9.  Con una lente convexa simple se pueden
visualizar estructuras de hasta 1 µm. Los
microscopios que utilizamos actualmente
tienen más de una lente, son compuestos.

10.  Aunque el aumento es muy importante, no
siempre es suficiente para que apreciemos los
detalles de un objeto. Los dos factores que
afectan a nuestra capacidad para ver una
imagen de calidad son el contraste y la
resolución.

11.  El contraste
 Diferencia en la intensidad luminosa que nos
permite diferenciar el objeto del fondo o
apreciar distintas partes del mismo.
 Depende de la cantidad de luz absorbida por el
objeto y la que es transmitida. Si un objeto y el
medio inmediato que lo rodea transmitieran la
misma cantidad de luz, la imagen del objeto no
se distinguiría del fondo.

12.  Algunos tipos de microscopios tienen
dispositivos para aumentar el contraste (ej.
Microscopio de contraste de fases, microscopio
de campo oscuro).

13.  Resolución
 El límite de resolución de un microscopio LR es
la mínima distancia a la que tienen que estar
dos puntos para que en la imagen se perciban
separados uno del otro. El poder de resolución
es mayor cuanto menor es el límite de
resolución (PR=1/LR)

14.  La resolución depende del sistema de lentes del
microscopio, no del objeto que se está estudiando; en
concreto depende de:
b) Tamaño de la primera lente de aumento llamada
Objetivo
c) Longitud de onda de la fuente de iluminación del
objeto
d) Índice de refracción (capacidad de desviación de la
luz) del material que se encuentre entre la lente del
objetivo y el especimen

15.  El límite de resolución disminuye (con lo que el
Poder de Resolución aumenta) disminuyendo
la longitud de onda (l) de la fuente de
iluminación, lo que puede conseguirse
iluminando con luz ultravioleta o con haces de
electrones.

16.  El poder de resolución es mayor al aumentar el
índice de refracción del medio que atraviesa la
luz, y puede aumentarse haciendo que la luz
atraviese un medio distinto al aire. El objetivo
de aceite de inmersión se utiliza sumergido en
un aceite especial que se coloca entre el porta
y el objetivo. El índice de refracción de la luz es
mayor en aceite (1,5) que en aire (1,0).

18.  El poder de resolución de un microscopio
aumenta considerablemente al utilizar como
una fuente de iluminación de menos longitud
de onda.

19. TIPOS DE MICROSCOPIOS

20. MICROSCOPIO DE CAMPO CLARO
 El microscopio de campo claro lleva la fuente
de luz incorporada en la base. La luz pasa a
través de un filtro azul que elimina longitudes
de onda largas y entra en el condensador. El
condensador hace incidir la luz en el
espécimen que absorbe parte de la luz.

21.  La luz transmitida por el espécimen entra en el
Objetivo y forma la primera imagen en el tubo
del microscopio. Posteriormente el Ocular
aumenta la imagen y la proyecta en la última
lente de la serie, la de nuestro ojo.

22.  Casi todos los microscopios actuales poseen
varios objetivos con distinto poder de
amplificación. Suelen disponer de un objetivo
de 10 aumentos (10x) uno de 40 aumentos
(40x) y uno de inmersión de 100 aumentos
(100x). Casi todos los oculares poseen una
capacidad de amplificar 10x la imagen
generada en el tubo del microscopio, lo que
hace que el número total de aumentos sea de
100x, 400x ó 1000x

23.  El objetivo de inmersión tiene un campo de visión
pequeño pero además del aumento proporciona más
detalle de la figura por su mejor resolución.
 Un microscopio compuesto ordinario proporciona una
iluminación de campo claro ya que el condensador
dirige la luz a través del espécimen y el fondo queda
iluminado de forma brillante. Los microscopios
compuestos pueden ser modificados para ver una
muestra mediante: Campo oscuro, Contraste de fases,
Fluorescencia o por Contraste Diferencial de
Interferencia (DIC).

25. MICROSCOPIO DE CAMPO OSCURO
 El microscopio de campo oscuro es un tipo de
microscopio óptico en el que se ha modificado
el sistema de iluminación de manera que la luz
incide sobre la muestra sólo desde los lados.
La única luz que es capaz de entrar en el
objetivo es la que, al ser dispersada por la
muestra, incide en el objetivo.
 Los microorganismos se observan brillantes
sobre un fondo oscuro.

28. MICROSCOPIO DE FLUORESCENCIA
 Las sustancias fluorescentes son capaces de emitir
una luz de mayor longitud de onda que la de la fuente
de luz con que son iluminadas. Cuando se iluminan
con luz uv (de longitud de onda corta, no visible) son
capaces de devolver luz visible, intensamente brillante
contra un fondo oscuro. Este microscopio lleva, una
fuente de luz uv para iluminar la muestra y un
condensador especial, de cuarzo, susceptible de ser
atravesado por la luz uv.

29.  La utilización de luz uv para iluminar la
muestra hace que el límite de resolución de
estos microscopios sea menor (y por tanto su
poder de resolución, mayor) que el de los
microscopios de campo claro.

30.  Algunos microorganismos son fluorescentes
por sí mismos, como algunas bacterias
fotosintéticas y algas, pero la mayoría no lo
son. Pueden observarse en este microscopio si
se tiñen con sustancias fluorescentes como:
2. la naranja de acridina,
3. la auramina
4. la rodamina.

31.  En la foto observamos Staphylococcus aureus
teñido con Naranja de Acridina

32.  La tinción de un microorganismo con
anticuerpos específicos unidos a compuestos
fluorescentes es de gran utilidad en el
diagnóstico de enfermedades infecciosas y una
de las aplicaciones más importantes de esta
microscopía.

33.  En la foto observamos Chlamydia teñida con
Anticuerpos fluorescentes

34. MICROSCOPIO DE CONTRASTE DE FASES
 En la microscopía de contraste de fases, el
aumento de contraste se consigue
aprovechando las pequeñas diferencias en los
índices de refracción entre los distintos
componentes celulares y el fondo. Diferencias
de espesor.

35.  De esta forma se pueden observar células
vivas, sin teñir, y por tanto estudiar el
movimiento celular. El contraste conseguido
permite también observar algunas estructuras
celulares internas.

36. MICROSCOPIO DE NOMARSKY
 La microscopía de Nomarsky o de contraste de
interferencia diferencial (DIC), se basa en el mismo
principio que la microscopía de contraste de fases,
pero utiliza un dispositivo distinto a los anillos
intercambiadores de fase para aumentar las
diferencias de los índices de refracción de las partes
del objeto. Este microscopio utiliza unos prismas en
los sistemas de lentes condensador y objetivo que
producen imágenes con mayor detalle que el
microscopio de contraste de fases y con aspecto
ligeramente tridimensional.

38. TIPOS DE MICROSCOPIOS

39.  El microscopio electrónico ha aumentado el
poder de resolución hasta 1000 veces con
respecto al microscopio óptico (m.e. alta
resolución). Esto ha sido posible cambiando la
fuente de iluminación a haces de electrones,
en lugar de rayos de luz.
 En las mejores condiciones el m.electrónico ha
conseguido aumentar el poder de resolución
del ojo humano 500.000 veces.

40.  Microscopio electrónico de transmisión: un haz
de electrones pasa a través de la muestra y
deja su impresión en una pantalla
fluorescente. Las áreas de la muestra que son
más transparentes aparecen de color brillante,
y las que son más opacas aparecen oscuras.
 El tubo del microscopio debe estar sometido al
vacío.

41.  Muestras a observar deben ser
extremadamente finas: < al µm, por lo que se
cortan con ultramicrotomos.
 No pueden utilizar lentes de vidrio (opacas a
los electrones), que son sustituidas por
electroimanes.
 Los portaobjetos de vidrio son sustituidos por
rejillas metálicas de unos 2mm.
 Poder de resolución: 0,2nm. 1000 veces más
que el m.óptico.
 1.000.000x aumentos

43.  Los electrones proceden de la superficie de la
muestra. Un sonda la recorre y bombardea con
un haz de electrones , y la propia superficie de
la muestra que está recubierta por una fina
capa de oro, emite unos electrones
secundarios que son los que se detectan en la
pantalla.
 Las depresiones y agujeros en la muestra
emiten pocos electrones secundarios, por lo
que aparecen oscuros.

44.  Las crestas y las puntas emiten gran número
de electrones secundarios y aparecen
brillantes.
 La imagen que observamos es tridimensional.
 Poder de resolución: 10nm

47. Fotos con Microscopio Electronico de Transmisión (M.E.T.).

48. Espermatozoide de conejo con M.E.T.

49. Espermatozoides de conejo con M.E.B.
Grano de polen

50.  MICROSCOPIOS CUÁNTICOS
 Permiten ver estructuras moleculares de la super
 Microscopio de efecto túnel (STM):
puede alcanzar aumentos de hasta 100
millones de veces.
 Microscopio de fuerza atómica (AFM):
puede alcanzar aumentos de hasta
1000 millones de veces.

51. MICROSCOPIO DE FUERZA ATÓMICA
DOBLE HÉLICE DE ADN