Técnicas de identificación de micobacterias atípicas en lesiones cutáneas
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Técnicas de identificación diagnóstico microbiológico de lesiones cutáneas causasdas por micobacterium marinum
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Técnicas de identificación de micobacterias atípicas en lesiones cutáneas
- 1. TÉCNICAS DE IDENTIFICACIÓN DE MICOBACTERIAS ATÍPICAS EN LESIONES CUTÁNEAS P. Sanz, R. Cenoz, Y. García, M. Beaumont, A. Ibáñez Servicio de Microbiología. Clínica Universidad de Navarra. Pamplona
- 2. Varón de 76 años de edad receptor de hígado. Lesión eritemato-costrosa post-traumática en dedo de mano derecha, durante labor de jardinería. Lesión con aspecto compatible con micosis subcutánea o micobacteriosis. Lesión de carácter crónico. Se solicitó identificación del agente causal mediante biopsia cutánea enviándose muestra al Servicio de Microbiología Clínica. DESCRIPCIÓN DE UN CASO CLÍNICO
- 3. BIOPSIA Diagnóstico microbiológico Micología Micobacterias Examen directo Cultivos Gram Sabouraud Glucose Agar (25ºC, 45ºC) Sabouraud Agar with Chloramphenicol (25ºC,45ºC) Brain Hearth Infussion Agar(37ºC,45ºC) Examen directo Cultivos Técnicas BM Kinyoun Lowenstein Jensen(LJ) (25ºC, 37ºC) Medio líquido Middlebrook 7H9 NASBA Pruebas Bioquimicas Técnicas BM GenoType CM GenoType AS Tween Urea Nitratos Pirazinamidasa ALGORITMO DE IDENTIFICACION
- 6. El estudio de sensibilidad se realizó por método de difusión en gradiente (E-test AB Biodisc) en agar Middlebrook 7H10, determinando la Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) frente a diversos antibióticos. ANTIBIOGRAMA MATERIAL Y MÉTODOS CMI
- 7. Cultivo micológico negativo a los 18 días. Observaciones directas realizadas sobre muestra (Gram y Kinyoun): negativas. Detección mediante NASBA: negativa. Cultivo en LJ a 25º C: colonias fotocromógenas de crecimiento rápido. Cultivo en LJ a 37º C: colonias fotocromógenas de crecimiento lento. Crecimiento de colonias en medio LJ RESULTADOS
- 8. Tinción de Kinyoun sobre colonias: bacilos ácido alcohol resistentes. Bacilos acido-alcohol resistentes en tinción de Kinyoun BAAR RESULTADOS
- 9. Características morfológicas y bioquímicas diferenciales de micobacterias causantes de lesiones cutáneas. Pruebas bioquímicas: Positivas: hidrólisis del Tween, ureasa, y pirazinamidasa Negativa: reducción de nitratos Identificación compatible con M. marinum . RESULTADOS ºC Tiempo (días) M. marinum F 30 5 A 14 + - + + M. fortuitum NC 27 3 A 5 V + + + M. chelonae NC 28 3 A 5 V - + + M. abscessus NC 35 3 A 5 V - + + M. avium NC 37 10 A 21 - - - + M. haemophilum NC 30 14 A 21 - - - + M. kansassi F 37 10 A 20 + + + - M. ulcerans E 32 28 A 60 - - V - Ureasa Pirazinamidasa Pigmento Crecimiento Hidrólisis Tween Reducción Nitratos
- 10. Confirmación de M. marinum , mediante Genotype Mycobacterium CM y Genotype Mycobacterium AS Hain Lifescience. Banda 10 Banda 15 Bandas obtenidas por PCR compatibles con M. marinum Banda 12 RESULTADOS
- 11. La micobacteria resultó ser sensible a todos los antibióticos estudiados. Resultados de susceptibilidad microbiana a diferentes antibióticos RESULTADOS Antibióticos CMI ( g/ml) Amoxicilina 0,047 Amikacina 0,023 Doxiciclina 0,032 Ceftriaxona 0,016 Levofloxacino 0,003 Meropenem 0,002 Rifampicina 0,047 Eritromicina 0,016 Trimetropin Sulfametoxazol 0,002
- 12. M icobacteria atípica distribuida en ambientes acuáticos. Causa infecciones oportunistas en humanos. Origina lesiones en piel (granuloma de las piscinas o granuloma de los acuarios). Diseminación a tejido celular subcutáneo, tendones y hueso en pacientes inmunodeprimidos. Infección adquirida por vía cutánea, tras traumatismo previo. Localización de las afecciones en EESS y EEII. Formación nódulos eritematosos de crecimiento progresivo. Mycobacterium marinum VIA DE INFECCION
- 13. Se identificó M. marinum mediante técnicas convencionales (tinción, cultivo y pruebas bioquímicas) y técnicas de BM. La posibilidad de realizar Análisis Genéticos Moleculares sobre medios de cultivo, permitió llegar a una identificación definitiva en menor tiempo que el resto de técnicas bioquímicas mencionadas anteriormente, pudiendo establecerse un diagnóstico precoz y tratamiento efectivo frente al agente etiológico. CONCLUSIONES
- 14. E.W. Koneman, S. D. Allen, W.M. Janda, Paul C. Schreckenberger ,W. C. Winn, (h). Color Atlas and Textbook of Diagnostic Microbiology-5th ed. Lippincott-Raven Publishers. 1997. p 868-919. Procedures For The Isolation And Identification Of Mycobacteria. 1975 Edition. U.S. Department Of Health, Education And Welfare. BIBLIOGRAFÍA
- 15. Departamento de Microbiología. Clínica Universidad de Navarra Dirección de Enfermería. Clínica Universidad de Navarra AGRADECIMIENTOS
Notas del editor
- Buenas tardes, soy Yasmina García del Dpto de Microbiología. En primer lugar queremos agradecer a Dirección de enfermería, por la oportunidad que nos ha brindado para presentar este trabajo durante esta jornada.
- A continuación vamos a presentar el caso clínico. Varón de 76 años, receptor de hígado, que acude al servicio de Dermatología por presentar una lesión eritemato-costrosa en 2º dedo de mano drcha, tras un traumatismo durante una labor de jardinería. Debido al carácter crónico de la lesión y al aspecto que esta presentaba, la sospecha se centró en una micosis subcutanea o una micobacteriosis. Para la identificación del agente causal se remitió una biopsia al Servicio de Microbiología.
- Aquí mostramos el algoritmo de identificación que siguió la muestra, tanto en el Laboratorio de Micología como en el de Micobacterias. Rosi espera a que por lo menos lo vean
- La identificación de micobacterias se realizó mediante caracterización fenotípica (morfología de colonias y Tª de crecimiento) y pruebas bioquímicas como: Ureasa CLICK Hidrólisis del Tween CLICK Reducción de nitratos y CLICK Pirazinamidasa. CLICK
- Además se realizarón técnicas de Biología Molecular como: Amplificación isoterma del RNA mediante la técnica NASBA, sobre muestra directa. Análisis Genetico Molecular basado en la tecnología DNA STRIP para detección de micobacterias atípicas. Cada una de las técnicas sigue los siguientes pasos: CLICK Aislamiento de RNA en muestras descontaminadas, mediante método de Captura con Partículas Magnéticas. Amplificación basada en la reacción NASBA. Hibridación reversa. CLICK Aislamiento de DNA procedente de cultivo (tubos de cultivo o medio líquido con crecimiento). Amplificación múltiplex con primers marcados con biotina. Hibridación reversa.
- El estudio de sensibilidad se realizó por método de difusión en gradiente en agar Middlebrook 7H10, determinando la Concentración Mínima Inhibitoria frente a diversos antibióticos. CLICK CLICK
- Los resultado obtenidos fueron los siguientes: El cultivo micológico fue negativo a los 18 días de incubación. Así mismo, la observación directa sobre la muestra .mediante la tinción de GRAM fue negativa. En el cultivo micobacteriologico, la observación sobre muestra directa mediante la tincion de Kinyoun fue negativa, así como la técnica NASBA. Tras varios días de incubación a 25ºC el medio de Lowestein jensen presentó colonias fotocromógenas, que más tarde tambien crecieron en un lowestein Jensen incubado a 37ºC.
- La tinción de Kinyoun de las colonias aparecidas en los tubos de Lowestein Jensen demostró la presencia de BAAR, tal y como muestra la Figura 2. CLICK CLICK CLICK CLICK
- Los resultados de las pruebas bioquímicas fueron positivas para: Hidrólisis del Tween, ureasa y Pirazinamidasa, siendo negativa la pruebas de reducción de nitratos. Este perfil de identificación fue compatible con M. marinum tal y como se muestra a continuación CLICK
- La confirmación de M. marinum , se realizó mediante Análisis genetico molecular con la aparición de las siguientes bandas: CLICK CLICK CLICK CLICK CLICK CLICK
- Las pruebas de susceptibilidad a diferentes agentes antimicrobianos, mostraron que M. narinum era sensible a los mismos. CLICK
- Micobacterium marinum es una micobacteria atípica,ampliamente distribuida en ambientes acuaticos que causa infecciones oportunistas en humanos. Origina lesiones en piel denominadas Granuloma de las piscinas o de los acuarios, pudiendo diseminarse a tejidos subcutaneos, tendones y hueso en pacientes inmunodeprimidos. La infección se adquiere por vía cutanea, siempre tras traumatismo previo. Esta infección se localiza principalmente en extremidades superiores e inferiores,donde porma nódulos eritematosos de crecimiento progresivo, que conflut¡yen dando lugar a placas de tamaño y forma variable.
- Conclusiones: Se identificó M. marinum mediante técnicas convencionales (tinción, cultivo y pruebas bioquímicas) y técnicas de BM. Tras lo estudiado podemos concluir que : La posibilidad de realizar Análisis Genéticos Moleculares sobre medios de cultivo permitió llegar a una identificación definitiva en menor tiempo que el resto de técnicas mencionadas anteriormente, pudiendo establecerse un diagnóstico precoz y tratamiento efectivo frente al agente etiológico.