El documento describe las etapas clave de la técnica de Western blot o inmunoblot. Primero, las proteínas de la muestra se separan mediante electroforesis en gel de poliacrilamida según su peso molecular. Luego son transferidas a una membrana donde se detectan con anticuerpos específicos. Finalmente, la unión antígeno-anticuerpo se detecta mediante métodos colorimétricos o de fluorescencia, permitiendo identificar proteínas específicas en la muestra original. El Western blot es una técnica analítica selectiva que permite

1. 1 Western blot o Inmunoblot
1. Introducción
El Western blot o inmunoblot es una técnica analítica usada para detectar
proteínas específicas en una muestra determinada (una mezcla compleja de
proteínas, como por ejemplo un extracto tisular).
Este método permite la detección de una sola proteína dentro de una muestra
biológica. Por lo tanto, es una técnica selectiva o específicica y se logra mediante la
utilización de un anticuerpo que reconoce y se une únicamente a la proteína de
interés.
2. Visión general de la técnica
Primero se lleva a cabo la preparación de la muestra mediante
métodos químicos y/o físicos. A continuación a través de una
electroforesis en gel de poliacrilamida se separan las proteínas
según su peso molecular. Luego son transferidas a una membrana
adsorbente (generalmente de nitrocelulosa), donde son detectadas con anticuerpos
que reconocen los antígenos que hay en ellas. Finalmente, se detecta la unión
antígeno (proteína)-anticuerpo por actividad enzimática, fluorescencia o colorimetría
entre otros métodos. De esta forma se puede estudiar la presencia de la proteína en el
extracto y analizar su cantidad relativa (semicuantitativa) respecto a otras proteínas.
Selectividad o Especificidad: Es la capacidad del método analítico para medir
inequívocamente al analito en presencia de otros componentes que pueda esperarse
que se encuentren presentes.
El tamaño de una proteína o de un polipéptido se informa como su masa en daltons
(un dalton es una unidad de masa atómica) o como su peso molecular (PM).

2. 2 Western blot o Inmunoblot
3. Etapas de lnumoblot o Western blot
3.1 Preparación de la muestra
Una adecuada preparación de la muestra es fundamental para llevar a cabo un ensayo
de Western Blot. Las muestras pueden ser tomadas de un tejido entero o de un cultivo
celular. En la mayoría de ensayos, las proteínas se extraen mediante procesos
químicos y/o mecánicos. El método elegido dependerá del tipo de muestra de partida.
En la tabla 1 se resumen los métodos mecánicos que se suele emplear en la
extracción de proteínas. (Las fotos de los métodos están en la presentación).
En cuanto a los métodos químicos, se emplea detergentes que rompen las
membranas celulares y solubilizar las proteínas (la muestra tiene que estar en
disolución). En la tabla 2 se clasifican los detergentes, más utilizados habitualmente,
según el tipo de proteína. (Solo leer)
Tabla 1 Tabla 2
Al llevar a cabo estos métodos, se produce la rotura celular, se liberan enzimas
proteasas que pueden degradar la proteína de interés. Por tanto, es importante evitar,
durante la preparación de la muestra:
 Evitar excesivos ciclos de congelación/descongelación.
 Trabajar rápido y mantener las muestras en frío durante todo el proceso.
 Añadir inhibidores de la proteasa.

3. 3 Western blot o Inmunoblot
3.2 Separación de las proteínas
La siguiente etapa consiste en la separación de proteínas se lleva a cabo mediante la
electroforesis en gel.
La electroforesis es una técnica de separación de moléculas (principalmente
proteínas y ácidos nucleicos) en una mezcla por aplicación de un campo eléctrico.
Las proteínas de la muestra serán separadas mediante una electroforesis en gel en
función de su peso molecular y carga eléctrica.
Recuerda: Las proteínas y los ácidos nucleicos poseen una carga
eléctrica, por lo tanto se desplazan cuando se ven sometidas a un
campo eléctrico. Como se puede ver en las siguientes estructuras
ambas biomoléculas tienen carga.
Desoxiribonucleosido Proteína
La electroforesis en gel más frecuente empleada en Inmunoblot es la conocida como
SDS-PAGE, la cual utiliza el gel de poliacrilamida (PAGE) y dodecilsulfato (SDS).
 Gel poliacrilamida (PAGE): el gel es el resultado de la polimerización química
de una mezcla de acrilamida y bisacrilamida. En función de las
concentraciones de cada acrilamida que se usen, se puede preparar varios
tamaños de poro. Por lo tanto actúa como tamiz.
https://www.youtube.com/watch?v=_8xftsCIwYo&t=61s
https://www.youtube.com/watch?v=NL1usCc0n38&t=90s
https://www.youtube.com/watch?v=HpPHN7fcLHI

4. 4 Western blot o Inmunoblot
Poliacrilamida 1 ( En color azul es la bisacrilamida)
 Dodecilsulfato (SDS):
Es un detergente aniónico que se une a las proteínas, desnaturalizándolas en una
conformación extendida recubierta de moléculas de SDS (carga negativa).
3.3 Transferencia de las proteínas a un soporte
Para que las proteínas sean accesibles a la detección por anticuerpos, se las
transfiere desde el gel de poliacrilamida a una membrana de nitrocelulosa. Esta
transferencia se puede realizar por difusión, por vacío o por acción de un campo
eléctrico (electrotransferencia). Esta última es la más habitual.

5. 5 Western blot o Inmunoblot
3.4 Incubación con anticuerpos
En esta etapa se comprueba la presencia en la membrana de una proteína específica.
Para ello se lleva a cabo en varias fases:
a) Bloqueo de las zonas con ausencia de proteínas y así evitar la unión no
específica de los anticuerpos
b) Se incuba con un anticuerpo primario que se une y marca la proteína de
interés.
c) Se adiciona un anticuerpo secundario marcado que se unirá de forma
específica al anticuerpo primario.
También hay métodos que utilizan un anticuerpo primario conjugado con un marcaje
detectable y se evitan adicionar el anticuerpo secundario.
El anticuerpo secundario puede estar:
 Ligados con un enzima como son la peroxidasa de rábano o la fosfatasa
alcalina, que en presencia de su sustrato, genere una reacción colorimétrica
(produce color).
 marcado radiactivo (emite radicación)
 marcado con una molécula fluorescente (emite fluorescencia)
3.5 Reconocimiento de las proteínas.
El último paso es el análisis de las proteínas dependiendo del tipo de anticuerpo
secundario que hayamos usado, lo analizaremos de una determinada forma.

6. 6 Western blot o Inmunoblot
Los métodos más comúnmente utilizados para detectar proteínas son:
4. Colorimetría
Los métodos colorimétricos utilizan un anticuerpo secundario que ha sido conjugado
previamente a un enzima (peroxidasa o fosfatasa alcalina).
Se adiciona un colorante como 4-cloro-1-naftol, que se une a la enzima y se forma un
producto azulado visible en la membrana.
5. Fluorescencia
Marcadores fluorescentes que van unidos al anticuerpo secundario, a los cuales se les
excita lumínicamente, y se detecta su cambio mediante un fluorómetros o fluorímetros
(los dispositivos que miden la fluorescencia).
Información adicional: Los colorantes son compuestos que absorben
determinadas longitudes de onda. En su estructura química suelen tener
dobles enlaces conjugados.

7. 7 Western blot o Inmunoblot
4. Aplicaciones
Sus aplicaciones son muy numerosas. Dentro del campo de la biomedicina tiene
aplicaciones:
• diagnósticas en enfermedades infecciosas,
• enfermedades hereditarias y congénitas,
• enfermedades autoinmunitarias,
• el diagnóstico precoz y el tratamiento como en investigación básica y
aplicada para el cáncer.
Otros campos en los que se utiliza esta técnica son:
• la inmunología: como la inflamación y el envejecimiento celular,
• en el ámbito de las enfermedades infecciosas y la microbiología, la
genética.
Un ejemplo real de la aplicación de esta técnica es:
“Se utilizó la técnica del inmunoblot para el diagnóstico de la cisticercosis porcina
usando un antígeno total de cisticercos de Taenia crassiceps. Fueron analizados 13
sueros del cerdo con cisticercosis, 30 sueros controles negativos y ocho sueros del
cerdo con hidatidosis, así como nueve del suino con macracantorincosis, 10 con
ascaridiosis y ocho con pulmonía”
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Preguntas de repaso
1. En la SDS-PAGE, una determinada proteína puede ser identificada en el gel
utilizando un anticuerpo específico
- Verdadero
- Falso
2. La electroforesis permite la separación de moléculas sometiéndolas a un
campo eléctrico
- Verdadero
- Falso
3. En la SDS-PAGE, gracias al dodecil sulfato sódico (SDS) la carga de las
proteínas es negativa
- Verdadero
- Falso

8. 8 Western blot o Inmunoblot
4. En la SDS-PAGE, las proteínas van cambiando su carga en función del pH del
tampón que hay en cada parte del gel
- Verdadero
- Falso
5. En la formación de las cadenas de polímeros intervienen tanto la acrilamida
como la bis-acrilamida
- Verdadero
- Falso
6. La PAGE de proteínas (sin añadir SDS) separa las proteínas en función de su
relación carga/masa
- Verdadero
- Falso
7. La SDS-PAGE permite calcular el peso molecular aproximado de un proteína
- Verdadero
- Falso
8. En la SDS-PAGE, las proteínas de menor peso molecular recorre más distancia
- Verdadero
- Falso
9. En la técnica electroforética denominada SDS-PAGE
a) Las muestras no se trata con SDS.
b) Las proteínas se separan en función de su masa molecular.
c) Las moléculas se mueven a través de acetato de celulosa.
d) La muestra se aplica en el ánodo (+)
10. En general, un inmunoblot realizado tras una electroforesis con SDS requiere:
a) Antígeno y anticuerpo posean cargas de signo opuesto.
b) Antígeno y anticuerpo sean sometidos simultáneamente a electroforesis.
c) El anticuerpo haya sido cometido a electroferesis.
d) Los anticuerpos puedan reconocer al antígeno desnaturalizado.
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1) ¿Cuál es la utilidad principal de la técnica de electroforesis?
2) ¿Qué matriz se utiliza en el SDS-PAGE y qué características tiene?
3) Justifica porque el Inmunoblot es una técnica analítica selectiva

9. Consulte los capítulos siguientes para obtener más detalles acerca de cada paso.
1. Western Blot: Visión General
Página 2
Western Blot:
Visión General
a. Preparación de la muestra
Extracción de las proteínas de
las muestras biológicas me-
diante disrupción mecánica o
química.
Los materiales de partida incluyen
planta, tejidos animales, células
cultivadas, levadura, o bacterias.
La disrupción mecánica
con un homogenizador
disgrega los tejidos.
Procesos adicionales
logran el fraccionamien-
to subcelular
Se usan tampones con-
teniendo detergentes
para la lisis celular
Figura 1. Preparación de muestras
b. Electroforesis en gel de
Acrilamida
Las proteínas en el extracto se
separan de acuerdo a su ta-
maño mediante electroforesis.
Se prepara un gel de acrilami-
da, bisacrilamida.
El dodecilsulfato de sodio
(SDS) añadido al gel se une a
las proteínas y confiere, de
forma proporcional a la masa
de cada proteína, una carga
negativa a cada una de ellas.
Figura 2. Electroforesis en Acrilamida
Se añade un coloran-
te de carga. Así, la
migración de la mues-
tra se puede monitori-
zar.
Se utiliza una pipeta para
cargar las muestras en los
pocillos del gel Una fuente de ali-
mentación propor-
ciona el voltaje
El gel se coloca dentro de un tanque
de electroforesis lleno de tampón,
que conducirá la corriente. La proteí-
nas con carga negativa migran des-
de el ánodo.
c. Transferencia electroforéti-
ca a una membrana
Las proteínas son transferidas
electroforéticamente a un
soporte rígido o membrana,
dónde quedan inmovilizadas.
El gel y la membrana se coloca
entre papel de filtro y almohadillas
de esponja..
Se aplica voltaje en el
tanque de transferencia y
las proteínas migran desde
el gel a la membrana.
Figura 3. Transferencia de Proteínas a la Membrana
Un cartucho aplica presión y
mantiene un estrecho contacto
entre el gel y la membrana.

10. a. Hibridación del Anticuerpo
La membrana con las proteí-
nas inmovilizadas debe tratar-
se para bloquear las zonas
con ausencia de proteínas y
así evitar la unión no específi-
ca de los anticuerpos.
A continuación se incuba con
un anticuerpo primario dirigi-
do contra el epítopo específi-
co de la proteína diana.
Tras varios lavados de la mem-
brana, se adiciona un anti-
cuerpo secundario marcado
que se unirá de forma especí-
fica al anticuerpo primario,
proporcionando una forma
de detección.
Figura 4. Hibridación de Anticuerpo
e. Detección de las Bandas
Después de un lavado de la
membrana para eliminar el
anticuerpo no unido, se pro-
cede a detectar la localiza-
ción de la banda en la mem-
brana. Para la detección de
quimioluminiscencia, se utiliza
un anticuerpo secundario
conjugado con el enzima pe-
roxidasa (HRP); la adición de
un sustrato de HRP provoca
una reacción enzimática que
da como resultado final la
emisión de luz. Dicha luz pue-
de ser detectada en una pelí-
cula de rayos X, o de forma
digital, mediante un sistema
de captación de imágenes.
La detección de fluorescen-
cia se basa en la captación
de luz emitid por sustancias
fluoróforas conjugadas con el
anticuerpo secundario.
Análisis de Proteínas
Página 3
Figura 5. Detección quimioluminiscente de las bandas de proteínas
Los materiales de partida incluyen
tejidos vegetales, tejidos animales,
células en cultivo, levadura, o bac-
terias.