1. MATERIA PRIMA E INSUMOS -LÁCTEOS
Ing. Nilza Ciriaco Reyes
PRACTICA Nº 04
DETERMINACIÓN DE ACTIVIDAD BIOLÓGICA EN LA LECHE
I. OBJETIVO:
Mostrar al estudiante la determinación de la actividad biológica de la leche.
II. PROCEDIMIENTO
Practica demostrativa con dinámica de grupo y apreciación personal de los equipos, técnica y
resultados.
III.ALGUNAS CONSIDERACIONES TEÓRICAS
Los microorganismos que se presentan con mayor incidencia en la leche, son aquellos que
fermentan la lactosa produciendo ácido láctico, a estos microorganismos se les llama
genéricamente lácticos.
Asumiendo que sea efectivo este predominio, es que se puede juzgar la calidad de la leche a partir
de los efectos que producen estos microorganismos. La determinación de la acidez, en cierta
medida, evalúa el grado de deterioro que han producido os microorganismos.
Sin embargo esta información si bien es útil, no es suficiente para el tecnólogo lechero, pues puede
ocurrir que reciba una leche en excelente estado, en cuanto a acidez, pero con una carga microbiana
láctica abrumadora, de modo que, en muy corto tiempo se va a producir el deterioro real de la
leche.
Se ve pues que la acidez mide el estado actual del producto, más es poco limitada en cuanto a
décimos algo sobre la capacidad de estabilidad del mismo, o dicho de otra manera, la acidez no
puede informarnos sobre el potencial de la actividad microbiana que puede ser un riesgo ya que
tiene la capacidad de acidificar la leche. De allí es que se pensó en pruebas como la del azul de
metileno, que permiten evaluar la actividad enzimática microbiana y a partir de este resultado,
presumir el futuro del producto, como también muy groseramente, conocer la carga microbiana
que lo acompaña.
El principio de la prueba se basa en que los microorganismos producen una acción reductora, que
se manifiesta al producirse la decoloración de sustancias como el azul de metileno. Luego
agregando cantidades fijas de azul de metileno, a 10 cc, de muestra de leche y observando el tiempo
de reducción, se puede concluir que, a mayor carga microbiana, el tiempo de reducción será menor,
lo que es lo mismo a decir que leches con tiempo corto de reducción, tienen un gran riesgo de
deteriorarse rápidamente, aún en el caso de presentar una acidez titulable normal. La propiedad de
reducción conducida por las enzimas, no es propiedad exclusiva de los microorganismos, sino
también es propiedad de la misma leche, y es el caso demostrado por Burri y Kurstein que la leche
recién esterilizada y preservada de la absorción de oxigeno decolora el azul de metileno.
Por otra parte Orla Jensen examinó unos cuantos gérmenes y le pareció que el Str. liquifaciens
poseía un mayor poder reductor que otros gérmenes lácticos. Rosell a su vez encontró que el Str.
Agalactide cuya presencia en la mastitis es frecuente no desarrollada reductasas (Rossell Dos
Santos).
IV.ANÁLISIS
4.1.Prueba de la Reductasa o del Azul de metileno
Generales: para esta determinación las muestras deben ser tomadas, transportadas y
manejadas con los mismos cuidados que para cualquier otra determinación de tipo
microbiológico.
Todos los tubos, tapas, pipetas, agua destilada para preparar la solución deben estar
esterilizados.
De usarse una sola pipeta para el muestreo ésta debe ser enjuagada y sumergida en agua
caliente después de cada toma de muestra.

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4.2.DESARROLLO DE LA PRACTICA
1. TOME 10 cc. DE LECHE EN UN TUBO DE PRUEBA ESTERIL SIGUIENDO LOS CUIDADOS DE
LAS TECNICAS MICROBIOLÓGICAS CONVENCIONALES.
2. AGREGUE 1cc. DE SOLUCIÓN DE AZUL DE METILENO DENTRO DE CADA TUBO.
La solución de azul de metileno se puede preparar sobre la base de pastillas que se
disuelven en 200 cc de agua destilada estéril y caliente en un frasco ámbar. De no haber
pastillas se puede usar azul de metileno medicinal (tiocinato de azul de metileno) en una
concentración en la solución de 55 partes por millón (hay otras opiniones sobre
concentración de la solución).
3. TAPE Y MEZCLE ELCONTENIDODELTUBOY DEJELOEN BAÑO MARIA A 37º C TENIENDO
CUIDADO QUE EL NIVEL DE LA LECHE ESTE POR DEBAJO QUE EL NIVEL DE AGUA.
4. CONTROLE EL TIEMPO A PARTIR DEL MOMENTO QUE DEJO EL TUBO EN BAÑO MARIA Y
OBSERVE A INTERVALOES REGULARES, PUDEN SER DE MEDIA HORA.
A. INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS
La tabla que figura es el producto de los trabajos de Barkworth y Davis. En forma parcial dan
una idea que puede, en algunos casos, estar lejos de la verdad, pero sin embargo puede servir
como pauta para el juzgamiento de la leche.
CUADR0 01: tiempo de reducción, recuento, acidez y periodo de conservación.
TIEMPO DE
REDUCCIÓN
RECUENTO EN PLACAS
NÚMERO /cc.
Acidez TITULABLE % TIEMPO DE
CONSERVACIÓN A 18ºC
hasta CPH (1) Horas
9 1,400 49
7-9 15,500 47
5 178,000 35
4 0.155 30
3 1 995 000 0.160 30
2 0.165 20
1 22 400 000 0.175 20
1/2 0.190 12
(1) CPH. Se llama a la prueba de coagulación por hervido, que se hace poniendo 5 ml de leche
en un tubo y se lleva a baño maría hirviendo 5 minutos. Luego se observa. Si la leche se
coagula indica para el caso el término de conservación del producto.
Otra tabla tomada de Rossel y Dos Santos con la misma reserva que la anterior, más o
menos dice lo mismo y clasifica la leche como sigue:
Calidad de la leche Tiempo de reducción Recuento en placas Conservación
Muy mala De 0.5 a 1 hora 5 millones a más De 15 a 22 horas
Mala De 2 a 3.3 horas De 700 000 a 5
millones
De 14 a más horas
Buena De 4 a 5.4 horas De 200 000 a 700 000 De 23 a 32 horas
Muy buena De 6 horas a más Hasta 200 000 Mas de 32 horas
Paralelamente a la prueba del azul de metileno hay otras, dentro de las cuales una muy
popular es la prueba de reducción con el empleo de RESAZURINA que se basa en el mismo
principio y procedimiento, pero con la ventaja de poder obtener resultados en un periodo
más corto que puede ser hasta de 10 minutos. Se emplean algunos equipos auxiliares
(discos de comparación colorimétrica).

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B. MUESTRAS, MATERIALES Y EQUIPOS
MATERIAL
- tubos de ensayo con tapón
- Pipetas de 10 ml.
- gradilla
- equipo de baño maría
- marcador de vidrio
REACTIVOS
- azul de metileno
MUESTRAS
 1 litro de leche descremada pasteurizada
 1 litro de leche entera pasteurizada
 1 litro de leche fresca de establo
4.3.INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS
 Los resultados obtenidos de las muestras evaluadas, deben reportarse en el cuadro
siguiente.
 Los resultados finales deben ser evaluadas y analizadas en función a las Normas
técnicas.
Calidad de la leche Tiempo de
reducción
ESTABLO PASTEURIZADA
E1 E2 E3 P1 P2 P3
Muy mala De 0.5 a 1 hora
Mala De 2 a 3.3 horas
Buena De 4 a 5.4 horas
Muy buena De 6 horas a más
E1: Chorrillos P1: LAIVE
E2: Lurín P2: GLORIA
E3: Agraria P3: AGRARIA
OBSERVACIONES:
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4.4. CUESTIONARIO
1. ¿Cuál es la importancia de la reduccióndel azul de metileno?
2. ¿Cómo influye en el tiempo la absorción del azul de metileno?
3. ¿Qué es la actividad Biológica?