1. Diagnóstico de Leptospirosis
por la Reacción en Cadena de la Polimerasa
(PCR)
Dra. Elthy Galarza R.

2. “PCR”
(Polymerase Chain Reaction)
Kary B. Mullis 1989.
Premio Nobel de Química en 1993.
Reacción en Cadena de la Polimerasa
Fundamento de la PCR

3. Técnica de la Reacción en Cadena de la
Polimerasa
Amplificar secuencias específicas de ADN in vitro

4. Definición de caso de Leptospirosis en humanos
(OMS/CDS/ISR/99.2 /A27 Leptospirosis)
• Clínica
• Epidemiología
• Diagnóstico Microbiológico

5. Leptospirosis en HumanosLeptospirosis en Humanos
Inmune y LepstospiruriaLeptospiremia
Fases
de la
Enfermedad
IgM
IgG
Concentración
de
Anticuerpos
Leptospira en:
Sangre
LCR
Orina
(reservorios)
Orina
(convalecientes)
Fiebre
UveítisEstado ConvalecienteEstado
Agudo
AñosMesesSemana 4Semana 3Semana 2Semana 1
Período de incubación
2 a 20 días
Inmune y LepstospiruriaLeptospiremia
Fases
de la
Enfermedad
IgM
IgG
Concentración
de
Anticuerpos
Leptospira en:
Sangre
LCR
Orina
(reservorios)
Orina
(convalecientes)
Fiebre
UveítisEstado ConvalecienteEstado
Agudo
AñosMesesSemana 4Semana 3Semana 2Semana 1
Período de incubación
2 a 20 días
Inmune y LepstospiruriaLeptospiremia
Fases
de la
Enfermedad
IgM
IgG
Concentración
de
Anticuerpos
Leptospira en:
Sangre
LCR
Orina
(reservorios)
Orina
(convalecientes)
Manifestaciones
Clínicas Diversas
- Forma leve o anictérica (90%)
UveítisEstado ConvalecienteEstado
Agudo
AñosMesesSemana 4Semana 3Semana 2Semana 1
Período de incubación
2 a 20 días

6. Métodos del Laboratorio de Microbiología
♦Cultivo
♦Inoculación en animales
♦Examen directo en campo oscuro ?
♦Impregnación argéntica
♦Inmunofluorescencia Directa
♦Inmunoperoxidasa
Métodos Bacteriológicos
♦Microaglutinación de serogrupos
♦ELISA
♦HA
♦Pesquisa
Métodos Serológicos
♦Hibridación de ácidos nucleicos
♦Reacción en cadena de la polimerasa
Métodos Biología Molecular

7. Diagnóstico del agente etiológico
Muestra clínica
(sangre - orina – LCR – órganos - tejido)
Frasco pequeño con medio de
cultivo para leptospiras,
sellado con tapón de goma y
retapa metálica.
Incubar a temperatura entre
28o
C – 30o
C
(como mínimo 7 días)
Observación microscópica semanal
(Si no hay crecimiento a los 6 meses eliminarlo)
Inocular en medio de cultivo para
leptospira
empleando tubos con tapas de rosca
Clasificación

8. Cultivo en medios selectivos
semanas - meses
Identificación
días - semanas
Diagnóstico directo de L. interrogans

9. Diagnóstico directo de L. interrogans
Cultivo en medios selectivos Técnica de la PCR
semanas - meses
Identificación
días - semanas
Horas
Identificación
minutos

10. Amplificación del ADNAmplificación del ADN
Por la PCRPor la PCR
PCR-Tiempo RealPCR-Tiempo RealPCR-ConvencionalPCR-Convencional
Diagnóstico molecular

11. PCR

12. Amplificación del ADN !!!!!!

13. Pasos
• Desnaturalización
• Acoplamiento
• Extensión
Técnica de la Reacción en Cadena de la Polimerasa
Reactivos de la mezcla
• ADN muestra
• Cebadores (primer)
• dNTP (dCTP, dGTP, dATP, dTTP)
• Enzima Taq polimerasa
• Solución de MgCl2
• Buffer para PCR

14. • PCR - Simple
• PCR - REA
• PCR - Múltiple
• Nested - PCR
• AP- PCR
• Real Time - PCR (PCR en tiempo real)
•
PCR:

15. • Regiones Universales (U)
• Regiones Semiconservadas (S)
• Regiones Variables (V)
ARN r 16S COMO MOLECULA DIANA
• Molécula evolutivamente muy estable.
• Alto número de copias por célula
(≈ 104
ribosomas/células).
• Especificidad puede ser manipulada. *
• Secuencias disponibles en Base de Datos.
• Métodos de secuenciación normalizados.
*

16. • Regiones Universales (U): Las secuencias son esencialmente
las mismas para todos los microorganismos.
• Regiones Semiconservadas (S): las secuencias son muy
similares entre los microorganismos estrechamente
relacionados
(Ej. Bacterias que pertenecen al mismo género)
• Regiones Variables (V) : Las secuencias varían entre especies
diferentes de bacterias y entre subespecies.
Regiones del ARN r 16 S

17. Amplificación del ADN
por el Método de la Reacción en Cadena de la Polimerasa
Muestras de orina y Clasificación de cepas
Electroforesis en gel de agarosa al 2%
ARN ribosomal 16S

18. Primer 1
Primer 2¨
PCR - REA
Sitio de corte

19. L. interrogans L. biflexa
PCR - REA

20. PCR - Múltiple
Se utilizan 2 juegos de cebadores

21. 812 pb
418 pb
280 pb
78 pb
PCR-Múltiple con 2 juegos de cebadores
PCR-Múltiple con 4 juegos de cebadores

22. PCR

23. PCR Tiempo Real
Mezcla de reacción
• ADN muestraADN muestra
• Juego de CebadoresJuego de Cebadores
• dNTPdNTP
• Buffer para PCRBuffer para PCR
• MgClMgCl22
• TaqTaq polimerasapolimerasa
• AguaAgua
• Sonda marcadaSonda marcada
• Sustancia intercalante al ADN de doble cadenaSustancia intercalante al ADN de doble cadena

24. PCR en Tiempo Real
Fragmento de ADN pequeño:
1321 ggatcatttg gattagtaag aagccaaaat gacaacttaa atatttcaag tgttacaaag
1381 aattctagtg atgataatct caagtatctc aatgctgttg agaaatacct tgatggtcag
1441 caaaactttg caatcagaag gtatgataac aacggtagag ctttatatga tattaactta
1501 gcaaaaatgg aaaacccctc aacggtgcaa aggggtttaa atggcgagcc tatctttgat
1561 ccttttaaag gctttggttt aactggtaat gcccctactg attggaatga gatcaaaggt

25. • Cebadores 1 y 2Cebadores 1 y 2
• dNTPdNTP
• Buffer 10XBuffer 10X TaqTaqManMan
• MgClMgCl22
• AguaAgua
• Sonda marcadaSonda marcada
• AmpliAmpli TaqTaq Gold (actividad nucleasa 5´- 3´)Gold (actividad nucleasa 5´- 3´)
Mezcla de Reacción

26. ¨quencher¨
- TAMARA: 6-carboxytetramethylrhodamine
5´ oligonucleótido 3´
¨reporter¨
- FAM: 6-carboxyfluorescein
- TET: tetrachloro-6-carboxyfluorescein
- JOE: 2,7,-dimethoxy-4,5-dichloro-6-carboxyfluorescein
- HEX: hexachloro-6-carboxyfluorescein
extremo 5´ con un ¨reporter¨
(sustancia fluorescente)
extremo 3´ con un ¨quencher¨
(sustancia bloqueadora)
Reporter actttgcaatcagaaggt Quencher
Sonda

27. GRACIAS !!!!